基因診斷與性病/生殖器皰疹
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生殖器皰疹是由單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus ，HSV）I型、Ⅱ型所致性病之一。近年來發病率明顯升高。在國內它還屬性病中新一代成員，人們對它的危害性沒有足夠的認識。單純皰疹病毒可引起皮膚、粘膜及多種器官感染。它可以通過性接觸感染而發生生殖器皰疹（Genital herpes）。生殖器皰疹病毒有兩個血清型；HSV-I和HSV-Ⅱ。大多數生殖器皰疹由HSV-Ⅱ引起，本病可呈慢性複發過程，目前尚未有根治的良藥。目前HSv 成為不少國家和地區生殖器潰瘍的首要病因，同時還和宮頸癌的發病及新生兒皰疹病的傳染有關。
目錄 |
第一節 病因學
單純皰疹病毒屬於病毒科，直徑180nm，是較大的DNA病毒。它可以分為HSV-1和HSV-2兩個亞型，它們在生物學、自然屬性以及人類對它們的免疫方面存在著不同。但這兩個亞型感染引起的病理生理卻相同。HSV的核酸結構為雙股線狀DNA，每股DNA分長、短兩個部分。分子量約為100×106道爾頓，15萬鹼基對，可編碼60個以上的基因產物。在DNA病毒中，單純皰疹病毒基因結構具有特殊性，因為它的兩個獨立的核苷酸序列兩側有倒置的重複序列，這兩個核苷酸序列能夠互相倒置聯繫，病毒DNA有四種異構體。HSV-1和HSV-2的病毒基因有50%左右的同源性。
HSV病毒形態呈球形，病毒核衣殼表面是由162個殼微粒組成的對稱20面體（100-110nm），其內是由DNA組成的核心，蛋白質外殼包繞著病毒基因組，外面有一層脂膜。在衣殼和包膜之間是一種多蛋白組成的被膜。HSV有三類基因，分別為α、β和γ基因。HSV感染神經細胞但不造成細胞死亡，病毒在感染細胞內處於抑制狀態，被感染細胞的存活與功能也不受影響，把這一過程稱為潛伏。病毒基因激活後病毒開始複製，有時可形成皰疹性損害，這一過程稱為複發。潛伏感染神經元細胞核內有大量的兩種RNA轉錄體，它們與稱作ICP-O的直接早期（α）基因產物重疊，這些RNA轉錄體按「反義」方向編碼，表示它們可能是β和γ蛋白轉錄的抑制因子，當病毒處於潛伏狀態時，其復活能力也被降低，對病毒潛伏的分子機理的了解可能有助於為預防HSV複發找到新途徑。
第二節 基因結構
一、基因組結構
HSV-2基因組為雙鏈線性DNA分子，鹼基組成含69%G+C，分子量為96×106D。根據基因組兩個通過共價鍵相連的分別被稱為L（長）和S（短）的組分的方位不同，HSV-2DNA可有四種異構體。L組分包括82%的病毒DNA，並且有一獨特序列「U」，其兩側有一反轉重複區域ab或b′a′，分別含6%病毒DNA。S組分佔18%的病毒DNA，也有一獨特序列（US），其兩側亦有反轉重複序列a′c′和ca。a′c′和ca分別含4.3%DNA。彼此相關的L和S序列的倒置衍生於位點特異性重組，重組是由末端「a」序列區的病毒基因產物介導的。HSV-2DNA兩端可連接成環狀，此結構與病毒的致癌與潛伏有關。HSV-2DNA中L和S的末端重複序列主要編碼特定的即刻早期轉錄產物，而獨特序列主要編碼特定的早期及晚期多肽和糖蛋白。
HSV-2有三類基因，即α、β、γ。其中α基因在感染中最早表達且不需要前病毒蛋白的合成；β基因的感染需要α蛋白的預先合成；γ基因的表達需要病毒DNA的複製。現已證實HSVmRNA可合成三類基本蛋白：急早期（immediate early，α）、早期（early，β）和晚期（late，γ）蛋白，β蛋白在DNA複製中起作用，包括胸苷激酶，DNA多聚酶及大多數DNA結合蛋白，而大部分糖蛋白則多為γ蛋白。HSV-2蛋白合成呈連鎖調節，即α基因產物誘導β基因表達，而β基因產物（加上一種α蛋白ICOP4）反過來又可終止α基因表達，同時誘導γ基因的表達，γ基因產物則可負調節β基因的表達並且可作為下一輪病毒複製合成α蛋白的起始信號。
迄今為止，已有6個編碼糖蛋白的基因已定位於HSV-2線性位點上，其基因產物分別被命名為gB、gC、gD、gE、gG和gH，編碼gB、gC的基因位於UL區，而編碼gD、gE、gG和gH的US區。
二、與誘導細胞轉化有關的基因定位
Aurelian對所有實驗中HSV-2感染的細胞株（包括腫癌細胞株）作了分析，發現病毒DNA共有的序列僅兩處，一處是Bg1ⅡG片段，位於0.21-0.33圖單位,該DNA序列與感染細胞在低血清培養劑中的增殖有關,而與病毒致癌無關;另一處是Bg1ⅡC片段,位於0.45～0.58圖單位,能誘導細胞轉化.HSV-2誘導倉鼠胚胎成纖維細胞轉化的DNA區域位於Bg1Ⅱ/Hpal-CD片段,相當於0.44～0.52圖單位.HSV-2DNA的Bb1ⅡN片段位於0.58～0.63圖單位,為形態學轉化區,已知0.58～0.628中無特定的編碼功能.L+K-細胞株或3T3tk-細胞株能通過HSV-2感染轉化成TK+表型,導致轉化所需的HSV-2DNA序列位於0.28-0.32圖單位。
第三節 流行病學
目前生殖器皰疹的流行情況在STD中非常引人注意，它已成為歐美最常見的性病之一。如英國自1971年的4000例增至1985年的20000例。在美國，1966-1984年已增加了15倍。估計美國人群累計病例超過3000萬。本病佔STD中第5位（7.7%
第四節 免疫學
患者機體對感染HSV的反應如何將直接影響機體是否發病及感染的嚴重程度、潛伏感染的發展和維持及HSV複發頻率。如患者有細胞免疫缺陷和體液免疫缺陷的HSV感染病情較為嚴重，說明抗體介導和細胞介導的免疫反應對HSV患者十分重要。動物實驗證明，T淋巴細胞，NK細胞和巨噬細胞在防止HSV擴散中起主要作用，抗體則有助於減低神經組織中病毒的含量。
在一定的條件下，特異性HSV多株抗體，HSV單株抗體，已接觸HSV抗原的淋巴細胞及針對病毒抗原克隆的T細胞都具有保護不患神經系統疾病或神經節潛伏感染。宿主的免疫反應在HSV發病機理方面可能也起一定的作用，HSV抗原的細胞免疫反應涉及多種細胞，如自然殺傷細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞亞群和由這些細胞產生的淋巴因子。給動物被動輸入已接觸過HSV抗原的淋巴細胞，再用病毒攻擊，動物可得到保護而不發病。最大保護作用需激活多種T細胞亞群。
通過對皰疹病損研究表明，CD8T淋巴細胞參與感染的控制，新生兒感染HSV時，其γ-干擾素的表達就顯著延緩。干擾素可能有直接的抗病毒效應或者可能激活其他非特異性效應細胞。
原發感染時，用放射免疫測定法和抗體依賴細胞毒試驗，在症状出現4天可檢測到HSv IgG抗體。而不依賴補體中和抗體和CF抗體通常要在症状出現後2-3周才測到。感染早期可測到HSV特異性IgM，IgM持續8周，但在潛伏感染及無症状感染者中則測不到IgM。一般情況下，無症状感染者和將複發皰疹者的HSv IgG、IgM或IgA抗體滴度無差異。
最近IgG亞型抗體的檢測，對IgG在生殖器皰疹的初感染、再發等也可檢出，而IgG2、3、4，在初感染中卻不能檢出。另外，有人報導有意思的是IgG4，女性比男性呈高頻率的檢出，但也有人追試這一測試卻得到不同結果。還有由Westernblot法可大量檢出。HSV的特異性蛋白質抗體，含有5-6種的糖蛋白，含免疫源性的蛋白，HSV-1就有23種，HSV-Ⅱ，也有10-15種，但對此類蛋白的抗體在臨床上尚無明確意義。
生殖器皰疹複發感染與抗體水平高低無關。在原發感染後，有高滴度Ne抗體的患者反比低滴度者更易複發。敏感的放射免疫測定法證實，病毒再激活時偶爾IgG、IgM和IgA抗體升高，在唇皰疹和生殖器皰疹病人，其HSv IgM抗體出現也不規則，故血清IgM抗體出現或滴度升高不是複發或無症状再激活的可靠判斷指標。
第五節 發病機理
HSV主要經過皮膚、粘膜或破損處進入人體內，首先在表皮或真皮細胞內複製。不論有無臨床症状，病毒在局部充分複製後感染感覺神經或自主神經未稍。病毒沿神經軸索進入神經節內的神經細胞中。動物實驗發現，從皮膚粘膜接種HSV到神經節內的神經細胞發現病毒，大約2天時間，可見其感染速度相當快。
HSV-1通常由呼吸道、消化道及皮膚粘膜密切接觸感染。所以HSV-1常潛伏在三叉神經根和頸上神經節內。故臨床所見主要是顏面部位的皰疹，HSV-2主要因性行為傳播，生殖器接觸而感染，所以HSV-2則常潛伏在骶神經節內，故臨床主要表現為生殖器皰疹。患者血清學均為陽性，可終生有泌尿生殖道HSV間歇性活動。
感染最初階段，病毒先在神經節及與之相接觸的神經組織內複製，然後通過感覺神經到達其未稍而使與之相關的皮膚、粘膜表面發生皮損。病毒從外周感覺神經擴散到皮膚、粘膜，這一情況，可以解釋表皮大面積受感染和遠離原發部位新病損發生的原因。原發性HSV感染病人常有這些特點，而且從遠離接種部位的神經組織中發現病毒。初次發病臨床症状消退後，在神經內不再分離到感染性病毒。在細胞表面也檢不出病毒蛋白。各種刺激因素，如免疫抑制、勞累、感染、精神創傷以及皮膚神經節創傷等都可引起病毒復活。
原發感染緩解後，神經節中找不到感染的病毒和病毒結構蛋白，潛伏感染神經細胞中的病毒基因組和顯性感染不同，前者HSV的DNA是環狀的，在潛伏感染的小鼠神經細胞核內和人的三叉神經節中檢出的RNA轉錄物中可與編碼早期基因ICPO的區域雜交，此RNA是編碼ICPO的DNA互補鏈轉錄來的。此「反義」RNA可能參與維持神經內潛伏感染但不參與建立潛伏感染，維持潛伏感染的機制不清楚，似乎潛伏感染的細胞僅有HSV蛋白質的部分轉錄。
第六節 臨床表現
一、症状
HSV感染是一種全身性疾病，病毒經呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進入人體，可潛於人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經節和多數器官內，幾乎所有的內臟和粘膜表皮內都可分離到HSV。
原發感染多為隱性，大多無臨床症状或呈亞臨床表現，僅有少數（約1-10%）可以出現臨床症状。主要見於免疫功能低下嬰幼兒或嚴重營養不良或有其它感染的兒童，成人罕見。原發感染消退後，病毒可持續潛居體內。正常人中約有半數以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由於HSV在人體中不產生永久免疫力，故每當機體抗病能力減退時，如患某種發熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環境改變時，體內潛伏的HSV即被激發而發病。
HSV-1主要引起口唇皰疹，咽炎，角膜結膜炎和散發性腦炎，而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹，但在臨床上也有相反情況。
HSV感染的潛伏期為1-45天，平均為6天，HSV-1感染主要發生於口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處，亦可見顏面或口唇，開始局部先有灼癢及輕度緊張感，偶有伴發神經痛。隨即出現紅斑，在紅斑基礎上發生簇集性小丘疹，迅速變為粟粒至綠豆大小的水皰，內容澄清，水皰破裂後出現糜爛面，數日後乾燥結痂。自覺灼癢，偶有倦怠，不適和輕微發熱等全身症状，癒合可遺留暫時性色素沉著。全病程1-2周左右。
HSV-2感染主要發生於生殖器部位，患部先有燒灼感，很快在紅斑的基礎上發生成群的小水皰，多見男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處，偶見於尿道；女性常見於陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰，約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍，自覺疼痛。病人可發生尿道炎，出現排尿困難。多數人有腹股溝淋巴結腫大疼痛，有的病人可出現發熱、肌肉痛及腦膜炎症状。如發於女性宮頸者可形成潰瘍壞死，陰道分泌物增多，可有下腹痛。應注意有無宮頸癌發生。孕期患生殖器皰疹時易致流產、早產或死胎，並易使新生兒感染，發生新生兒單純皰疹。本病一般經過3周左右可以痊癒，但常有反覆發作，一般原發疹後1-4個月內複發，症状較原發者輕，範圍亦小，局限於生殖器部位，有時僅有1-2個皰疹，病程亦短，自發病至癒合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及中樞神經系統等。
二、體征
皮損為紅斑基礎上可見成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎，宮頸可見發紅、糜爛、潰瘍，有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現在口唇、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部與咽喉。並發腦膜炎或橫貫性脊髓炎，一般於發疹後3-12天出現頸項強直等顱內壓增高的現象。
三、潛伏感染和複發
HSV感染人體後1周左右，血中出現中和抗體，3-4周達高峰，可持續多年，這些抗體能清除病毒和使機體康復，但大多數個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止複發，病毒以潛伏狀態長期存在宿主體內。不同亞型HSV感染者急性首發生殖器皰疹的臨床過程相似，但生殖器病變複發率不同，首發HSV-2感染者約90%，在12個月內會出現一次複發（平均複發4次），而初次感染HSV-1者僅50%出現類似複發（平均複發次數小於1）。不同個體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的複發率變化很大，大多數年複發5-9次，一般在原發皰疹消退後1-4個月內發生，有些患者受到促發因素，如發熱、月經、日晒、寒冷、某些病毒感染等的影響而複發，其特點是每次複發往往發生在同一部位，複發前可有前驅症状如局部瘙癢，發疹前數小時感染部位有灼燒，麻刺感。
複發生殖器皰疹（GH）對患者心理影響較大，由於目前尚無預防複發的有效療法及可能有誘發生殖器惡變的危險性，故給患者帶來心理影響，患者多有抑鬱、恐懼等心理障礙，這又直接影響HSV的複發。我們的治療經驗，只要患者堅持規律治療，都能治癒。
四、HSV與HIV感染：
HSV常與HIV-1同時感染，並能促進病情發展，引起嚴重的局部和播散性感染。目前認為HSV是一種調節因素，能激活HIV複製，Heng對6例AIDS合併生殖系統HSV皮膚損害患者進行皮膚活檢，發現角化細胞和巨噬細胞均有HIV-1和HSV-1雜交後使HIV-1保留其感染性，而無需與CD4分子結合即能進入細胞內。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的複製。
第七節 組織病理
表皮細胞發生氣球樣變性，其中可見有嗜酸性包涵體。表皮開始為網狀變性形成的多房性水皰，以後聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫，有輕重不等炎性細胞浸潤。反應嚴重時可有嚴重血管炎表現。
第八節 診斷
HSV感染的診斷要依據病史、臨床表現和實驗室檢查結果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現皮膚紅斑和原發性水皰，易複發等不難診斷。必要時可作皰液塗片，培養、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助於診斷和確定病毒類型。
一、細胞學方法
對皮損刮片做Wright-Gemsa （Tzanck試驗）或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特徵的巨細胞包函體，但不能區別HSV感染或水痘— 帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。
二、培養法
從水皰底部取材做組織培養分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。
三、抗體檢測
目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區分HSV-1和HSV-2的優點。
四、基因診斷
（一）用PCR分型檢測單純皰疹病毒
PCR是一種敏感性高，特異性強的快速檢測方法，標本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發展較快，且分型檢測HSV是發展的趨勢。
1、標本採集和處理
（1）標本採集
①腦脊液：直接無菌採取患者0.5ml腦脊液標本於無菌試管送檢.如肉眼可見血色,應離心取上清。
③腦組織: 腦組織屍檢、活檢標本,加1ml PBS標本緩衝液研磨後，待檢。
④眼及皮膚病灶分泌物：用預測（半干）棉拭子直接取患處分泌物，置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
⑤生殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖）標本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
（2）標本處理
①預處理：所有液體標本均可直接進行模板製備；可以取100μl標本液，離心5000r/ min×5min後，去上清，取沉澱物進行模板製備。
②模板製備：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h後，煮沸10 min，離心5000 r/ min×5min，收集上清。 b:水煮法：沉澱物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton X-100裂解法:取採集的標本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取採集的標本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000r/ min×5min收集上清。e:如標本溶血嚴重經上述裂解處理後，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉澱DNA，加10μlDW溶解待檢。
2、PCR擴增
（1）引子設計。以HSV DNA聚合酶的高保守區為檢測靶序列以確保特異性。設計3個引子，一個上游共同性引子，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二個下游特異性引子，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ ）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分別擴增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2 391bp片段（1561～1953）：從二型PCR擴增產物中設計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5『GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3『）。
（2）PCR實驗體系。取模板10μl： DNAP5 0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTp 8μl(4×200μmol/L)；10×緩衝液10μl：DMSO 4μl；加DW65.5μl；石蠟油 30μl.。
| 水煮（96℃～100℃）7min |
| 加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U） |
| 72℃4 min ↓ 95℃40s ↓ 65℃60s →72℃70s ↓33個循環 70℃4 min |
3．擴增產物的檢測和分析
（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產物20μl加樣品緩衝液4μl混勻後，點樣於2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB）染色5min，於紫外燈下觀察結果在溴酚藍後面有一條或二條亮紅帶為陽性結果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則為陰性結果。
（2）XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產物50μl加XhoI50U，37℃1h後，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產生46bp片段帶（引子後面）；與正常PCR產物比較，XhoI酶切後的大片段電泳位置前移。
（3）Southern印跡法：PCR產物20μl經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預雜交（雜交液中）30min，加入32p標記HSVP3探針後,42℃雜交過夜；次日用1%SDS/ PBs pH7.2, 42℃洗15min， 0.5%SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X線暗盒內放射性自顯影12～15h,顯影為陽性, 不顯影為陰性。
（二）套式PCR
套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通過「外側」、「內側」兩對引子，即一對擴增較大DNA片段的「外側」引子和一對位於擴增產物中再擴增小片段的「內側」引子，這樣兩次連續放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應改進分型檢測HSV，更好地在臨床應用和基礎研究中推廣應用。
1、 標本處理：
（1）標本採集同上
（2）DNA 製備：①腦脊液：取100μlCSF 水煮15min,加入250μl無水乙醇，放-30℃10min；離心10000g30 min，去上清，30℃乾燥後，加入10μl DW； ②腦組織細胞：取沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min；取上清加入等體積酚一氯仿（V/V），輕搖10 min，離心10000r/min×10min;取水相，加入250μl DW溶解。
2、PCR擴增
(1)引子設計：選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。
NP-PCR 的引子和探針序列
| 「外」引子 | ||
| BJHSV1.1 | ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA | 19-43 |
| BJHGV1.2 | CATACCGGAACGCACCACACAA | 218-239 |
| 「內引子」 | ||
| BJHSV1.3 | CCATACCGACCACACCGACGA | 51-79 |
| BJHSV1.4 | CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA | 166-188 |
| 探針 | ||
| BJHSV-1PRO | TACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT | 96-125 |
(2) PCR實驗體系和程序: 反應體積為50μl；模板10μl；BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×緩衝液5μl； 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl; 石蠟油30μl。循環參數為95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循環20次, 取其擴增產物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應體系中進行套式擴增,先95℃變性2min，循環參數為95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循環30次後，72℃延伸5min;。
(3) 擴增產物分析：
① 瓊脂糖凝膠電泳染色法：
取擴增產物10μl點樣於2%瓊脂糖凝膠中， 70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min，於紫外燈下觀察結果,在溴酚蘭後面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結果,HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則為陰性結果。
② Southern印跡法：
PCR產物20μl 經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預雜交（雜交液中）30min，加入32P標記HSV探針後，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBs pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X線暗盒內，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽性，不顯影為陰性。
（三）、聚合酶鏈反應—酶譜法（polymerase chain reaction-endonucleasecleavage PCR-EC）
具有經濟廣泛等特點；不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受。可檢出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經系統感染第1dCSF中HSv DNA陽性結果，並可用於藥物治療效果的評價。由於病毒的變異性，會出現酶切點突變丟失現象，從而造成酶切陰性結果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。
1. 標本處理
（1） 標本採集，方法同上。
（2） DNA模板製備：每份標本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；
加入等體積的酚—氯仿（v/v）輕搖10min，離心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉澱DNA，離心15000r/min×5min,吸去液體，30℃乾燥後,加蒸餾水25μl溶解,待檢。
2. 引子設計：
P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
（1）PCR實驗體系：
反應體積100μl； 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×緩衝液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循環參數為94℃60s;60℃60s; 72℃60s；循環40次℃延伸4min。
（2）擴增產物檢測與酶切分型.
①第一步電泳鑒定: 取10μlPCR產物加4μl樣品緩衝液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min後,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴增產物大小。
②酶切分析：分別取20μlPCR產物於2個Eppendorf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉澱DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應緩衝液溶解，加入SmaI或BamHi50U於相應Eppendorf 管內，37℃作用1h。
③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩衝液，加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min後,EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產物相對照。 紫外燈下觀察,結果如下:
PCR-EC法檢測四種病毒結果
| 病毒型號 | 靶片段 | SmaI | BamHI |
| HSV1 | 518bp | 476bp+42bp | |
| HSV2 | 518bp | — | 225+293bp |
| EBV | 524bp | 100bp+424bp | 277bp+247bp |
| CMV | 589bp | 不需酶切,第一步電泳就可以區分 |
（四）用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應（RNA-PCR），可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利於HSV的潛伏期感染機制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為模板經逆轉錄反應（RT）產生cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增以達到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標本處理：
組織塊細胞總RNA提取，取100mg組織標本，加1ml硫氰酸胍變性液，於勻漿器中，室溫研磨均勻後，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s, 置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質)加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉澱RNA。離心 15000r/min×10min,棄上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉澱,-20℃1h, 沉澱RNA. 離心15000r/min×10min,去上清, 沉澱RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空乾燥。.加10μl TE緩衝液（pH7.4）溶解,低溫保存備用.臨用前冰浴溶解。
2、PCR擴增:
（1） 引子設計: 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設計2個引子，
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。
1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
（2）PCR實驗體系：總反應體積為50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1 1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl（200μmol/L)； 10×緩衝液5μl； AMV(逆轉錄酶)2μl(50U)； DW 26μl； 循環參數, 94℃變性2min後 94℃50s，60℃60,72℃60s，循環40次後72℃延伸5min。
3、擴增產物的鑒定：
（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴增產物加4μl 樣品緩衝液，混勻後加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。
（2）Southern印跡雜交法：用32P標記的特異性探針檢測PCR產物，方法同上。
總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低複製的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測，遠較DNA探針敏感，並能在血清中抗體出現前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎研究手段，還是作為臨床檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。
五、病理組織學診斷
細胞內水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細胞浸潤，特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥於病灶中間。
第九節 鑒別診斷
主要與硬下疳，軟下疳鑒別：硬下疳為單個質硬的潰瘍，無疼痛感，無複發史，實驗檢查USR（+）或RPR（+），梅毒螺旋體可見。軟下疳為質軟的潰瘍，局部雖有疼痛感但無複發史，實驗檢查鏈桿菌陽性。
其他生殖器部位皮膚病如接觸性帶狀皰疹、白塞病。膿皰病有時與生殖器皰疹相似，可以從病史及檢查方面相區別。
第十節 治療
本病有自限性，約1-2周即可自愈。治療的目的是防止下次複發。本病目前尚無特效藥物，治療原則為縮短病程，防止繼發感染，減少複發。
1．局部療法：原則為乾燥、收斂、保護患部，防止繼發感染。可外塗2%龍膽紫溶液，或選用10%次沒食子酸鉍（代馬妥dermatol）、氧化鋅油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5%新黴素軟膏、或0.25%~0.1%皰疹淨（IDU）軟膏、5%皰疹淨二甲基亞碸溶液（用於皮膚皰疹）等。對顏面部者亦可用10%醋酸鋁或鋅銅合劑。
2．全身治療：治療原則其一使感染的HSV不能活化，甚至消滅病毒；其二調節免疫，防止再發，可用阿昔洛韋靜滴或口服，麗珠威口服，干擾素肌注，白細胞介素Ⅱ肌注。我們在治療複發性生殖器皰疹時，使用四醫大生物技術中心產的干擾素300萬單位肌注，每日一次，10次為一療程，共三個療程，適當配合使用白細胞介素Ⅱ或利百或靈桿菌素，95%的病人不複發。
下面介紹別人治療皰疹方法供參考：
一、 抗HSV藥物
（一）無環烏苷是公認的有效藥物：
1．原發和初發感染：ACV200mg，每日5次，連服7天；或ACv 5mg/kg，按體重靜注，8小時一次，連續5-7天。
2．複發感染時，ACV 200mg，每日5次，連服5天，或ACV800mg，每日2次，連服5天；若在剛開始出現前驅症状時或在損害出現後的2天內即開始治療，則對部分患者可能有效
3．複發頻繁時：ACV200mg，每日3次，可連續服用6-12個月。在經常複發的患者中（每年>6次），每日治療至少可以減少75%的複發次數，在接受長達3年治療的人群，已確定是安全有效的。從接受治療的人群中已分離到耐ACV的HSV株，但免疫功能正常者未見治療失敗者。治療1年後應停藥，以便重新評價患者的複發率。
4．免疫受抑制患者：首發或複發的急性患者：靜注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV400mg×4次/日，共7-10天；抑制複發：每天靜注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV（400mg×3-5次/天），可預防複發。
5．HSV直腸炎，ACV 400mg，每日5次，可縮短病程。免疫受抑制或重症者可靜注ACV5mg/kg/8h。
6．新生兒HSV：現有資料認為，不應該常規應用ACV治療通過產道感染的無症状嬰兒，治療僅限於有HSV臨床表現及產後病毒培養陽性的患兒。所有新生兒HSV感染者應接受ACV或阿糖腺苷治療。常採用ACV300mg/kg/d，阿糖腺苷30mg/kg/d，靜脈注射共10-14天。
7．合併HIV感染：患者需口服ACV間歇或每日抑制治療。對合併HIV感染者增加ACV劑量是十分有益的。
ACV400mg，口服，每日-5次，治療有效，應持續用藥直至臨床症状消失；對重症者，應用ACV靜脈給藥，對可疑或已證實的ACV耐藥株引起的重症患者，最佳方案可能是：ACV400mg/kg，靜脈注射，每8小時一次，直至臨床痊癒。
HIV感染者中的皮膚損傷粘膜HSV感染時大劑量ACV治療無反應者日益增多。大劑量ACV對部分患者有助於損傷的癒合，但不能阻止另外一些患者的病情進展。對複發頻繁者長期服用ACV不能制止繼續排毒，因此，仍可對性伴感染，此時若改用作用機理不同的抗病毒藥物如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。
ACV的抗病毒機理是它很容易被HSV編碼的胸苷激酶磷酸化，形成ACV-MP，再被細胞激酶作用而形成ACV-TP。ACV-TP與dGTP競爭而抑制病毒DNA合成。
ACV全身應用治療首次臨床發作或作為抑制治療藥物時，可使皰疹發作的症状和體徵得到控制。然而，該藥既不能根除潛伏病毒感染，也不能影響以後發作的次數和嚴重性。該藥局部治療的效果比口服差，故不提倡局部用藥。
ACV可縮短生殖器皰疹病程，加速癒合及緩解症状，長期應用可減少複發，曾有人對11000例免疫正常的GH連續治療5年，在此期間複發率明顯降低。
但是長期口服ACV不能清除骶神經節的潛伏病毒，停藥後生殖器皰疹仍可複發，對ACV有耐藥性的病毒株越來越多，幾乎所有耐藥性都發生於曾經進行多個病程治療的免疫受損害者。
ACV靜脈應用的主要副作用是由於藥物在腎實質內結晶而引起的暫時性腎功能不全。若緩慢給藥一小時以上或大量飲水則可避免此副作用。
（二）、病毒唑（三氮唑核苷，Ribavin RBV）：抑制病毒多種DNA及RNA複製，合成。
用量：原發GH及AIDS合併HSV感染，15mg/kg/d，肌注；複發GH，0.4g,口服,每日4次,3天後改為0.4g,每日2次,共5天,療效肯定,用於耐藥病毒株。
（三）、磷甲酸（TrisodiumPhosphonoformate，PFA）；選擇性抑制皰疹病毒誘導的DNA依賴的DNA聚合酶，主要用於耐ACV病毒株的感染。
用量：40-60mg/kg/d，靜脈注射，每8小時1次，連用4次，可用於AIDS合併HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有腎毒性及鈣磷代謝紊亂。
（四）、雙羥丙氧甲基烏苷（更昔洛韋，Ganciclovir，DNPG）：是ACV的衍生物，通過抑制病毒DNA複製，導致RNA合成受阻，感染細胞DNA多聚酶是作用的靶部位。
用量：5-10mg/kg/d，分3次靜注，連續14天，副作用有造血系統抑制及肝損害。
（五）、氟阿糖碘胞苷（FIAC）：對HSV-1和HSV-2有同樣作用，選擇性作用於被病毒感染的細胞，其代謝產物5-碘尿嘧啶、5-甲尿嘧啶均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成，有廣譜抗病毒活性，副使用少，不能防止潛伏感染的建立，但防止病毒進入中樞神經系統有一定保護作用。抗HSV單株抗體局部外用，對GH有治療作用，國外有人報導治療HSV-2總有效率92.6%，基本治癒率44.1%。
（六）、消炎痛（Indomethacin）：作用為抑制前列腺素合成，有助於減少GH的複發，促進conA及PHA（植物血凝素）刺激所發生的細胞增殖作用，加強NK細胞的殺傷能力，可用於複發GH的治療，用量：25mg口服，每日3次。
（七）、聚肌胞（PolyZIC）：是人工合成的干擾素誘導劑，能刺激吞噬作用，增強抗體形成，對免疫系統起調節使用。用量2mg，肌注，2-3次/周。
二、對妊娠GH的處理
對孕婦使用無環鳥苷的安全性尚未肯定，但研究發現，用ACV的孕婦畸胎髮生率與正常人相比，並無增高，但ACV對妊娠及胎兒的危險性尚未得出可靠結論。
對威脅母親生命的HSV感染，如腦炎，肺炎及肝炎，應採用ACV靜脈用藥，但無威脅生命的HSV感染，不必全身用ACV治療。
依照美國傳染病學會建議，對妊娠期反覆發作的GH處理方案如下：
（一）分娩時如無活動性生殖器損害，則無需剖腹產；
（二） 妊娠未3個月，症状性複發是短暫的，只要分娩時無活動性損害，可經陰道分娩。
（三）臨產時有活動GH者，可作如下處理：①羊膜未破，孕婦不發熱，胎兒尚未成熟，應延緩分娩；②如系足月妊娠，羊水已破，胎兒肺已成熟，應行剖腹產。
第十一節 預防與護理
（一）避免不潔性交及不正當的性關係，活動性生殖器瘡疹患者絕對禁止與任何人發生性關係；
（二）治療期間禁行房事，必要時配偶亦要進行檢查；
（三）對局部損害的護理，應注意保持清潔和乾燥，防止繼發感染。
（四）治癒後或有複發者，要注意預防感冒，受涼，勞累等誘發因素，以減少複發。
目前尚無特異性預防方法，動物實驗表明，接種HSV死疫苗或減毒活疫苗，均有免疫效果，因此病毒與某些癌症的關係密切，故不作常規預防使用。最近用純化的皰疹病毒包膜糖蛋白作疫苗，可避免皰疹病毒DNA的致癌危險性。
ACV也有預防作用。陰莖套可能減少疾病的傳播，尤其是在無症状排毒期，但出現生殖器損害時，使用陰莖套也不能避免傳播。
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