核酸

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   核酸指由許多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物,為生命的最基本物質之一。最早由米歇爾於1868年在膿細胞中發現和分離出來。核酸廣泛存在於所有動物、植物細胞、微生物內、生物體核心酸常與蛋白質結合形成核蛋白。不同的核酸,其化學組成、核苷酸排列順序等不同。根據化學組成不同,核酸可分為核糖核酸,簡稱RNA和脫氧核糖核酸,簡稱DNA。DNA是儲存、複製和傳遞遺傳信息的主要物質基礎,RNA在蛋白質合成過程中起著重要作用,其中轉移核糖核酸,簡稱tRNA,起著攜帶和轉移活化胺基酸的作用;信使核糖核酸,簡稱mRNA,是合成蛋白質的模板;核糖體的核糖核酸,簡稱rRNA,是細胞合成蛋白質的主要場所。核酸不僅是基本的遺傳物質,而且在蛋白質的生物合成上也占重要位置,因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現象中起決定性的作用。

核酸在實踐應用方面有極重要的作用,現已發現近2000種遺傳性疾病都和DNA結構有關。如人類鐮刀形紅血細胞貧血症是由於患者的血紅蛋白分子中一個胺基酸的遺傳密碼發生了改變,白化病患者則是DNA分子上缺乏產生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致。腫瘤的發生、病毒感染射線對機體的作用等都與核酸有關。70年代以來興起的遺傳工程,使人們可用人工方法改組DNA,從而有可能創造出新型的生物品種。如應用遺傳工程方法已能使大腸桿菌產生胰島素干擾素等珍貴的生化藥物。  

目錄

核酸研究的歷史

核酸是怎麼發現的?

1869年,F.Miescher從膿細胞中提取到一種富含磷元素的酸性 化合物,因存在於細胞核中而將它命名為"核質"(nuclein)。核酸 (nucleic acids),但這一名詞於Miescher的發現20年後才被正式啟 用,當時已能提取不含蛋白質的核酸製品。早期的研究僅將核酸看成 是細胞中的一般化學成分,沒有人注意到它在生物體內有什麼功能 這樣的重要問題。

核酸為什麼是遺傳物質?

1944年,Avery等為了尋找導致細菌轉化的原因,他們發現從S 型肺炎球菌中提取的DNA與R型肺炎球菌混合後,能使某些R型菌轉化 為S型菌,且轉化率與DNA純度呈正相關,若將DNA預先用DNA酶降 解,轉化就不發生。結論是:S型菌的DNA將其遺傳特性傳給了R型 菌,DNA就是遺傳物質。從此核酸是遺傳物質的重要地位才被確立, 人們把對遺傳物質的注意力從蛋白質移到了核酸上。

雙螺旋的發現

核酸研究中劃時代的工作是Watson和Crick於1953年創立的DNA 雙螺旋結構模型。模型的提出建立在對DNA下列三方面認識的基礎上:

1.核酸化學研究中所獲得的DNA化學組成及結構單元的知識,特 別是Chargaff於1950-1953年發現的DNA化學組成的新事實;DNA中四 種鹼基的比例關係為A/T=G/C=1;

2.X線衍射技術對DNA結晶的研究 中所獲得的一些原子結構的最新參數;

3.遺傳學研究所積累的有關 遺傳信息的生物學屬性的知識。綜合這三方面的知識所創立的DNA雙 螺旋結構模型,不僅闡明了DNA分子的結構特徵,而且提出了DNA作 為執行生物遺傳功能的分子,從親代子代的DNA複製 (replication)過程中,遺傳信息的傳遞方式及高度保真性。其正確 性於1958年被Meselson和Stahl的著名實驗所證實。DNA雙螺旋結構 模型的確立為遺傳學進入分子水平奠定了基礎,是現代分子生物學 的里程碑。從此核酸研究受到了前所未有的重視。

對核酸研究有突出貢獻的科學家

沃森

Watson, James Dewey

美國生物學家

克里克

Crick, Francis Harry Compton

英國生物物理學家

日新月異的研究進展

三十多年來,核酸研究的進展日新月異,所積累的知識幾年就 要更新。其影響面之大,幾乎涉及生命科學的各個領域,現代分子 生物學的發展使人類對生命本質的認識進入了一個嶄新的天地。雙 螺旋結構創始人之一的Crick於1958年提出的分子遺傳中心法則 (centraldogma)揭示了核酸與蛋白質間的內在關係,以及RNA作為遺 傳信息傳遞者的生物學功能。並指出了信息在複製、傳遞及表達過 程中的一般規律,即DNA→RNA→蛋白質。遺傳信息以核苷酸順序的 形式貯存在DNA分子中,它們以功能單位在染色體上佔據一定的位置 構成基因(gene)。因此,搞清DNA順序無疑是非常重要的。1975年 Sanger發明的DNA測序(DNAsequencing)加減法為實現這一企圖起了 關鍵性的作用。由此而發展起來的大片段DNA順序快速測定技術──Maxam 和Gilbert的化學降解法(1977年)和Sanger的末端終止法(1977年), 已是核酸結構與功能研究中不可缺少的分析手段。我國學者洪國藩 於1982年提出了非隨機的有序DNA測序新策略,對DNA測序技術的發 展作出了重要貢獻。目前,DNA測序的部分工作已經實現了儀器的自 動化操作。憑藉先進的DNA測序技術及其它基因分析手段,人類正在 進行一項以探明自身基因組(genome)全部核苷酸順序(單倍基因組 含3×109鹼基對)為目標的宏偉計劃──人類基因組圖譜製作計劃 (human genome mapping project)。據稱,此項計劃的實現,將對 全人類的健康產生無止境的影響。 Watson-Crick模型創立36年後的1989年,一項新技術──掃描隧道 顯微鏡(scanning tummeling microscopy, STM)使人類首次能直接 觀測到近似自然環境中的單個DNA分子的結構細節,觀測數據的計算 機處理圖像能在原子級水平上精確度量出DNA分子的構型、旋轉周 期、大溝(major groove)及小溝(minor groove)。這一成果是對DNA 雙螺旋結構模型真實性的最直接而可信的證明。此項技術無疑會對 人類最終完全解開遺傳之謎提供有力的幫助。可喜的是,我國科學 家在這項世界領先的研究中也佔有一席之地。  

核酸的化學成分

核酸是由什麼組成的?

核酸是生物體內的高分子化合物。它包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)和核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)兩大類。DNA和RNA都是由一個一個核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的,由C、H、O、N、P5種元素組成。RNA平均長度大約為2000個核苷酸,而人的DNA卻是很長的,約有3X109個核苷酸。

核苷酸的組成有什麼規律?

單個核苷酸是由含氮有機鹼(稱鹼基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分構成的。

鹼基(base):構成核苷酸的鹼基分為嘌呤(purine)和嘧啶 >(pyrimi-dine)二類。前者主要指腺嘌呤(adenine,A)和鳥嘌呤(guanine,G),DNA和RNA中均含有這二種鹼基。後者主要指胞嘧啶(cytosine,C)胸腺嘧啶(thymine,T)和尿嘧啶(uracil,U),胞嘧啶存在於DNA和RNA中,胸腺嘧啶只存在於DNA中,尿嘧啶則只存在於RNA中。這五種鹼基的結構如圖。

嘌呤環上的N-9或嘧啶環上的N-1是構成核苷酸時與核糖(或脫氧核糖)形成糖苷鍵的位置。

此外,核酸分子中還發現數十種修飾鹼基(themodifiedcomponent),又稱稀有鹼基,(unusualcomponent)。它是指上述五種鹼基環上的某一位置被一些化學基團(如甲基化、甲硫基化等)修飾後的衍生物。一般這些鹼基在核酸中的含量稀少,在各種類型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修飾鹼基主要見於噬菌體DNA,RNA中以tRNA含修飾鹼基最多。

戊糖(五碳糖):RNA中的戊糖是D-核糖(即在2號位上連接的是一個羥基),DNA中的戊糖是D-2-脫氧核糖(即在2號位上只連一個H)。D-核糖的C-2所連的羥基脫去氧就是D-2脫氧核糖。

戊糖C-1所連的羥基是與鹼基形成糖苷鍵的基團,糖苷鍵的連接都是β-構型。

核苷(nucleoside):由D-核糖或D-2脫氧核糖與嘌呤或嘧啶通過糖苷鍵連接組成的化合物。核酸中的主要核苷有八種。

核苷酸(nucleotide):核苷酸與磷酸殘基構成的化合物,即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的結構單元。核酸分子中的磷酸酯鍵是在戊糖C-3』和C-5』所連的羥基上形成的,故構成核酸的核苷酸可視為3』-核苷酸或5』-核苷酸。DNA分子中是含有A,G,C,T四種鹼基的脫氧核苷酸;RNA分子中則是含A,G,C,U四種鹼基的核苷酸。

當然核酸分子中的核苷酸都以形式存在,但在細胞內有多種游離的核苷酸,其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。

類別 DNA RNA
基本單位 脫氧核糖核苷酸 核糖核苷酸
核苷酸 腺嘌呤脫氧核苷酸

鳥嘌呤脫氧核苷酸

胞嘧啶脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸
腺嘌呤核苷

鳥嘌呤核苷酸

胞嘧啶核苷酸

尿嘧啶核苷酸
鹼基 腺嘌呤(A)

鳥嘌呤(G)

胞嘧啶(C)

胸腺嘧啶(T)
腺嘌呤(A)

鳥嘌呤(G)

胞嘧啶(C)

尿嘧啶(U)
五碳糖 脫氧核糖  核糖
磷酸  磷酸 

 

核苷酸是怎麼連接的?

3』,5』-磷酸二酯鍵:核酸是由眾多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸(polynucleotide),相鄰二個核苷酸之間的連接鍵即:3』,5』-磷酸二酯鍵。這種連接可理解為核苷酸糖基上的3'位羥基與相鄰5'核苷酸的磷酸殘基之間,以及核苷酸糖基上的5'位羥基與相鄰3'核苷酸的磷酸殘基之間形成的兩個酯鍵。多個核苷酸殘基以這種方式連接而成的鏈式分子就是核酸。無論是DNA還是RNA,其基本結構都是如此,故又稱DNA鏈或RNA鏈。DNA鏈的結構如下示意圖。

寡核苷酸(oligonucleotide):這是與核酸有關的文獻中經常出現的一個術語,一般是指二至十個核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性多核苷酸片段。但在使用這一術語時,對核苷酸殘基的數目並無嚴格規定,在不少文獻中,把含有三十甚至更多個核苷酸殘基的多核苷酸分子也稱作寡核苷酸。寡核苷酸目前已可由儀器自動合成,它可作為DNA合成的引子(primer)、基因探針(probe)等,在現代分子生物學研究中具有廣泛的用途。

核酸鏈的簡寫式:核酸分子的簡寫式是為了更簡單明了的敘述高度複雜的核酸分子而使用的一些簡單表示式。它所要表示的主要內容是核酸鏈中的核苷酸(或鹼基)。下面介紹二種常用的簡寫式。

字元式:書寫一條多核苷酸鏈時,用英文大寫字母縮寫符號代表鹼基(DNA和RNA中所含主要鹼基及縮寫符號見表1-1),用小寫英文字母P代表磷酸殘基。核酸分子中的糖基、糖苷鍵和酯鍵等均省略不寫,將鹼基和磷酸相間排列即可。因省略了糖基,故不再註解「脫氧」與否,凡簡寫式中出現T就視為DNA鏈,出現U則視為RNA鏈。以5'和3'表示鏈的末端及方向,分別置於簡寫式的左右二端。下面是分別代表DNA鏈和RNA鏈片段的二個簡寫式:

5'pApCpTpTpGpApApCpG3'DNA

5'pApCpUpUpGpApApCpG3'RNA

此式可進一步簡化為:

5'pACTTGAACG3'

5'pACUUGAACG3'

上述簡寫式的5'-末端均含有一個磷酸殘基(與糖基的C-5'位上的羥基相連),3'-末端含有一個自由羥基(與糖基的C-3'位相連),若5'端不寫P,則表示5'-末端為自由羥基。雙鏈DNA分子的簡寫式多採用省略了磷酸殘基的寫法,在上述簡式的基礎上再增加一條互補鏈(complentarystrand)即可,鏈間的配對鹼基用短縱線相連或省略,錯配(mismatch)鹼基對錯行書寫在互補鏈的上下兩邊,如下所示:

5'GGAATCTCAT3'

3'CCTTAGAGTA5'

5'GGAATC錯配)

線條式:在字元書寫基礎上,以垂線(位於鹼基之下)和斜線(位於垂線與P之間)分別表示糖基和磷酸酯鍵。如下圖所示

上式中,斜線與垂線部的交點為糖基的C-3'位,斜線與垂線下端的交點為糖基的C-5'位。這一書寫式也可用於表示短鏈片段。不難看出,簡寫式表示的中心含義就是核酸分子的一級結構,即核酸分子中的核苷酸(或鹼基)排列順序。  

核酸的分解代謝

核酸的合成實質上是DNA或者RNA鏈的複製,前面已經談到,不再複述。  

核酸的分解代謝:

從前面的描述我們也可以看得很清楚,核酸氧化分解後變成了磷酸和鹼基的嘌呤和嘧啶,目前還沒有發現嘧啶有何害處,但嘌呤無疑是導致人類尿酸增高和痛風的主要原因。

核酸氧化分解---生成嘌呤---嘌呤在肝臟進一步氧化成為(2,6,8--三氧嘌呤)又稱為尿酸,尿酸鹽沉積到關節腔等組織引起痛風發作。

因此,核酸不是越多越好,同時,這也說明了為什麼中老年易患痛風,因為年紀來了,大量的細胞死亡,而細胞內有大量的核酸,生存嘌呤,再生成尿酸,從而導致痛風發作。防治好痛風就是要防止核酸被氧化。  

核酸的相關分類

核酸(nucleic acid)是重要的生物大分子,它的構件分子是核苷酸(nucleotide)。

天然存在的核酸可分為:

╭ 脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)

╰ 核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)

DNA貯存細胞所有的遺傳信息,是物種保持進化和世代繁衍的物質基礎。

RNA中參與蛋白質合成的有三類:

╭ 轉移RNA(transfer RNA,tRNA)

∣ 核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)

╰ 信使RNA(messenger RNA,mRNA)

20世紀末,發現許多新的具有特殊功能的RNA,幾乎涉及細胞功能的各個方面。

核苷酸可分為:

╭ 核糖核苷酸:是RNA的構件分子

╰ 脫氧核糖核苷酸:是DNA構件分子。

細胞內還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物,它們具有重要的生理功能。

核苷酸由:

╭ 核苷(nucleoside)

╰ 磷酸(Phosphonic.acid)

核苷由:

╭ 鹼基(base)

╰ 戊糖(Pentose)

鹼基(base):

構成核苷酸中的鹼基是含氮雜環化合物,由嘧啶(pyrimidine)和嘌呤(purine)構成。

核酸:

╭ 嘌呤鹼 :

╭ 腺嘌呤

∣ ╰ 鳥嘌呤

╰ 嘧啶鹼 :

╭ 胞嘧啶

∣ 胸腺嘧啶

╰ 尿嘧啶

╭ DNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶,胸腺嘧啶主要存在於DNA中。

╰ RNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶,尿嘧啶主要存在於RNA中。

在某些tRNA分子中也有胸腺嘧啶,少數幾種噬菌體的DNA含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。這五種鹼基受介質pH的影響出現酮式、烯醇互變異構體

在DNA和RNA中,尤其是tRNA中還有一些含量甚少的鹼基,稱為稀有鹼基(rare bases)稀有鹼基種類很多,大多數是甲基化鹼基。tRNA中含稀有鹼基高達10%。

戊糖:

核酸中有兩種戊糖DNA中為D-2-脫氧核糖(D-2-deoxyribose),RNA中則為D-核糖(D-ribose)。在核苷酸中,為了與鹼基中的碳原子編號相區別核糖或脫氧核糖中碳原子標以C-1』,C-2』等。脫氧核糖與核糖兩者的差別只在於脫氧核糖中與2』位碳原子連結的不是羥基而是氫,這一差別使DNA在化學上比RNA穩定得多。

核苷:

核苷是戊糖與鹼基之間以糖苷鍵(glycosidic bond)相連接而成。戊糖中C-1』與嘧啶鹼的N-1或者與嘌吟鹼的N9相連接,戊糖與鹼基間的連接鍵是N-C鍵,一般稱為N-糖苷鍵。

RNA中含有稀有鹼基,並且還存在異構化的核苷。如在tRNA和rRNA中含有少量假尿嘧啶核苷(用ψ表示),在它的結構中戊糖的C-1不是與尿嘧啶的N-1相連接,而是與尿嘧啶C-5相連接。

核苷酸:

核苷中的戊糖5』碳原子上羥基被磷酸酯化形成核苷酸。核苷酸分為核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸兩大類。依磷酸基團的多少,有一磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷。核苷酸在體內除構成核酸外,尚有一些游離核苷酸參與物質代謝能量代謝與代謝調節,如三磷酸腺苷(ATP)是體內重要能量載體;三磷酸尿苷參與糖原的合成;三磷酸胞苷參與磷脂的合成;環腺苷酸(cAMP)和環鳥苷酸(cGMP)作為第二信使,在信號傳遞過程中起重要作用;核苷酸還參與某些生物活性物質的組成:如尼克醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),尼克醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。  

核酸的分子結構

一、 核酸的一級結構

核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子。組成DNA的脫氧核糖核苷酸主要是dAMP、dGMP、dCMP和dTMP,組成RNA的核糖核苷酸主要是AMP、GMP、CMP和UMP。核酸中的核苷酸以3』,5』磷酸二酯鍵構成無分支結構的線性分子。核酸鏈具有方向性,有兩個末端分別是5』末端與3』末端。5』末端含磷酸基團,3』末端含羥基。核酸鏈內的前一個核苷酸的3』羥基和下一個核苷酸的5』磷酸形成3』,5』磷酸二酯鍵,故核酸中的核苷酸被稱為核苷酸殘基。。通常將小於50個核苷酸殘基組成的核酸稱為寡核苷酸(oligonucleotide),大於50個核苷酸殘基稱為多核苷酸(polynucleotide)。

二、 DNA的空間結構

(一)DNA的二級結構

DNA二級結構即雙螺旋結構(double helix structure)。20世紀50年代初Chargaff等人分析多種生物DNA的鹼基組成發現的規則。

DNA雙螺旋模型的提出不僅揭示了遺傳信息穩定傳遞中DNA半保留複製的機制,而且是分子生物學發展的里程碑。

DNA雙螺旋結構特點如下:①兩條DNA互補鏈反向平行。②由脫氧核糖和磷酸間隔相連而成的親水骨架在螺旋分子的外側,而疏水的鹼基對則在螺旋分子內部,鹼基平面與螺旋軸垂直,螺旋旋轉一周正好為10個鹼基對,螺距為3.4nm,這樣相鄰鹼基平面間隔為0.34nm並有一個◦的夾角。③DNA雙螺旋的表面存在一個大溝(major groove)和一個小溝(minor groove),蛋白質分子通過這兩個溝與鹼基相識別。④兩條DNA鏈依靠彼此鹼基之間形成的氫鍵而結合在一起。根據鹼基結構特徵,只能形成嘌呤與嘧啶配對,即A與T相配對,形成2個氫鍵;G與C相配對,形成3個氫鍵。因此G與C之間的連接較為穩定。⑤DNA雙螺旋結構比較穩定。維持這種穩定性主要靠鹼基對之間的氫鍵以及鹼基的堆集力(stacking force)。

生理條件下,DNA雙螺旋大多以B型形式存在。右手雙螺旋DNA除B型外還有A型、C型、D型、E型。此外還發現左手雙螺旋Z型DNA。Z型DNA是1979年Rich等在研究人工合成的CGCGCG的晶體結構時發現的。Z-DNA的特點是兩條反向平行的多核苷酸互補鏈組成的螺旋呈鋸齒形,其表面只有一條深溝,每旋轉一周是12個鹼基對。研究表明在生物體內的DNA分子中確實存在Z-DNA區域,其功能可能與基因表達的調控有關。DNA二級結構還存在三股螺旋DNA,三股螺旋DNA中通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結合,三股螺旋中的第三股可以來自分子間,也可以來自分子內。三股螺旋DNA存在於基因調控區和其他重要區域,因此具有重要生理意義。

(二) DNA三級結構——超螺旋結構

DNA三級結構是指DNA鏈進一步扭曲盤旋形成超螺旋結構。生物體內有些DNA是以雙鏈環狀DNA形式存在,如有些病毒DNA,某些噬菌體DNA,細菌染色體與細菌中質體DNA,真核細胞中的粒線體DNA、葉綠體DNA都是環狀的。環狀DNA分子可以是共價閉合環,即環上沒有缺口,也可以是缺口環,環上有一個或多個缺口。在DNA雙螺旋結構基礎上,共價閉合環DNA(covalently close circular DNA)可以進一步扭曲形成超螺旋形(super helical form)。根據螺旋的方向可分為正超螺旋和負超螺旋。正超螺旋使雙螺旋結構更緊密,雙螺旋圈數增加,而負超螺旋可以減少雙螺旋的圈數。幾乎所有天然DNA中都存在負超螺旋結構。

(三) DNA的四級結構——DNA與蛋白質形成複合物

真核生物中其基因組DNA要比原核生物大得多,如原核生物大腸桿菌的DNA約為4.7×103kb,而人的基因組DNA約為3×106 kb,因此真核生物基因組DNA通常與蛋白質結合,經過多層次反覆摺疊,壓縮近10 000倍後,以染色體形式存在於平均直徑為5μm的細胞核中。線性雙螺旋DNA摺疊的第一層次是形成核小體(nucleosome)。猶如一串念珠, 核小體由直徑為11nm×5.5nm的組蛋白核心和盤繞在核心上的DNA構成。核心由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子組成,為八聚體,146 bp長的 DNA以左手螺旋盤繞在組蛋白的核心1.75圈,形成核小體的核心顆粒,各核心顆粒間有一個連接區,約有60 bp雙螺旋DNA和1個分子組蛋白H1構成。平均每個核小體重複單位約佔DNA 200 bp。DNA組裝成核小體其長度約縮短7倍。在此基礎上核小體又進一步盤繞摺疊,最後形成染色體。

(四)DNA結構的多態性

Watson和Crick所推導出來的DNA結構在生物學研究中有深遠意義。他們是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92%相對溫度下進行X-射線衍射圖譜為依據進行推設的。在這一條件下得出的DNA稱B構象。實際上在溶液中的DNA的確呈這一構象,這也是最常見的DNA構象。但是,研究表明DNA的結構是動態的。在以鈉、鉀或銫作反離子,相對溫度為75%時,DNA分子的X-射線衍射圖給出的是A構象。這一構象不僅出現於脫水DNA中,還出現在RNA分子中的雙螺旋區域的DNA-RNA雜交分子中。如果以鋰作反離子,相對溫度進一步降為66%,則DNA是C構象。但是這一構象僅在實驗室中觀察到,還未在生物體中發現。這些DNA分子中G-C鹼基對較少,這些分子將取D和E構象。這些研究表明DNA的分子結構不是一成不變的,在不同的條件下可以有所不同。但是,這些不同構象的DNA都有共同的一點,即它們都是右手雙螺旋;兩條反向平行的核苷酸鏈通過Watson-Crick鹼基配對結合在一起;鏈的重複單位是單核苷酸;這些螺旋中都有兩個螺旋溝,分為大溝與小溝,只是它們的寬窄和深淺程度有所不同。

但是,Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X-射線衍射圖譜時分別發現這種六聚體的構象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋,在主鏈中各個磷酸根呈鋸齒狀排列,有如「之」字形一樣,因此叫它Z構象(英文字Zigzag的第一個字母)。還有,這一構象中的重複單位是二核苷酸而不是單核苷酸;而且Z-DNA只有一個螺旋溝,它相當於B構象中的小溝,它狹而深,大溝則不復存在。

立即就有幾個問題被提了出來:這種結構是怎樣生成的?這一結構在天然狀態下存在嗎?它有什麼生物學意義?

研究表明,Z-DNA的形成是DNA單鏈上出現嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。這種鹼基排列方式會造成核苷酸的糖苷鍵的順式和反式構象的交替存在。當鹼基與糖構成反式結構時,它們之間離得遠;而當它們成順式時,就彼此接近。嘧啶糖苷鍵通常是反式的,而嘌呤糖苷酸鍵既可成順式的也可成反式的。而在Z-DNA中,嘌呤鹼是順式的。這樣,在Z-DNA中嘧啶的糖苷鏈離開小溝向外挑出,而嘌呤上的糖苷鍵則彎向小溝。嘌呤與嘧啶的交替排列就使得糖苷鍵也是順式與反式交替排列,從而使Z-DNA主鏈呈鋸齒狀或「之」字形。

人們相信,並用實驗證明細胞DNA分子中確實存在有Z-DNA區。而且,細胞內有一些因素可以促使B-DNA轉變為Z-DNA。比如,胞嘧啶第五位碳原子的甲基化,在甲基周圍形成局部的疏水區。這一區域擴伸到B-DNA的大溝中,使B-DNA不穩定而轉變為Z-DNA。這種C5甲基化現象在真核生物中是常見的。因此在生物B構象的DNA中某些區段具有Z-DNA構象是可能的。DNA真是一個構象可變動態分子。

Z-DNA有會麼生物學意義呢?應當指出Z-DNA的形成通常在熱力學上是不利的。因為Z-DNA中帶負電荷的磷酸根距離太近了,這會產物靜電排斥。但是,DNA鏈的局部不穩定區的存在就成為潛在的解鏈位點。DNA解螺旋卻是DNA複製和轉錄等過程中必要的環節,因此認為這一結構位點與基因調節有關。比如SV40增強子區中就有這種結構,又如鼠類微小病毒DNS複製區起始點附近有GC交替排列序列。此外,DNA螺旋上溝的特徵在其信息表達過程中起關鍵作用。調控蛋白都是通過其分子上特定的胺基酸側鏈與DNA雙螺旋溝中的鹼基對一側的氫原子供體受體相互作用,形成氫鍵從而識別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調控蛋白質對DNA信息的識別。Z-DNA中大溝消失,小溝狹而深,使調探蛋白識別方式也發生變化。這些都暗示Z-DNA的存在不僅僅是由於DNA中出現嘌呤-啶嘧交替排列之結果,也一定是在漫漫的進化長河中對DNA序列與結構不斷調整與篩選的結果,有其內在而深刻的含意,只是人們還未充分認識而已。

DNA構象的可變性,或者說DNA二級結構的多態性的發現拓寬了人們的視野。原來,生物體中最為穩定的遺傳物質也可以採用不同的姿態來實現其豐富多彩的生物的奧妙,也讓人們在這一領域中探索和攀越時減少疲勞和厭倦,樂而忘返,從而有更多更新的發現。

多年來,DNA結構的研究手段主要是X射線衍線技術,其結果是通過間接觀測多個DNA分子有關結構參數的平均值而獲得的。同時,這項技術的樣品分析條件使被測DNA分子與天然狀態相差甚遠。因此,在反映DNA結構真實性方面這種方法存在著缺陷。1989年,應用掃描隧道顯微鏡(STM)研究DNA結構克服了上述技術的缺陷。這種先進的顯微技術,不僅可將被測物放大500萬倍,且能直接觀測接近天然條件下單個DNA分子的結構細節。應該說它所取得的DNA結構資料更具有"權威性"。表1-6是STM測到的B-DNA結構參數及其與X射線衍線資料的比較結果。STM研究還證實了d(CG)重複序列的寡核苷酸片段為Z-DNA結構的事實。STM技術的應用是DNA結構研究中的重要進展,可望在探索DNA結構的某些未知點上展示巨大潛力。

三、基因與基因組

(一) 基因(gene)的現代分子生物學概念是指能編碼有功能的蛋白質多肽鏈或合成RNA所必需的全部核酸序列,是核酸分子的功能單位。一個基因通常包括編碼蛋白質多肽鏈或RNA的編碼序列,保證轉錄和加工所必需的調控序列和5』端、3』端非編碼序列。另外在真核生物基因中還有內含子等核酸序列。

(二)基因組(genome)是指一個細胞或病毒所有基因及間隔序列,儲存了一個物種所有的遺傳信息。在病毒中通常是一個核酸分子的鹼基序列,單細胞原核生物是它僅有的一條染色體的鹼基序列,而多細胞真核生物是一個單倍體細胞內所有的染色體。如人單倍體細胞的23條染色體的鹼基序列。多細胞真核生物起源於同一個受精卵,其每個體細胞的基因組都是相同的。

1. 病毒基因組 

2.原核生物基因組 

3.真核生物基因組 

在高等真核生物中基因序列占整個基因組不到10%,大部分是非編碼的間隔序列。人類基因組研究結果發現在人的基因組中與蛋白質合成有關的基因只佔整個基因組2 %。真核生物基因組的最大的特點是出現分隔開的基因,在這類基因中有編碼作用的序列稱外顯子(exon),沒有編碼作用的序列稱內含子(intron),它們彼此間隔排列。

四、各類RNA的結構

絕大部分RNA分子都是線狀單鏈,但是RNA分子的某些區域可自身回折進行鹼基互補配對,形成局部雙螺旋。在RNA局部雙螺旋中A與U配對、G與C配對,除此以外,還存在非標準配對,如G與U配對。RNA分子中的雙螺旋與A型DNA雙螺旋相似,而非互補區則膨脹形成凸出(bulge)或者環(loop),這種短的雙螺旋區域和環稱為髮夾結構(hairpin)。髮夾結構是RNA中最普通的二級結構形式,二級結構進一步摺疊形成三級結構,RNA只有在具有三級結構時才能成為有活性的分子。RNA也能與蛋白質形成核蛋白複合物,RNA的四級結構是RNA與蛋白質的相互作用。

(一) tRNA的結構

tRNA約佔總RNA的15%,tRNA主要的生理功能是在蛋白質生物合成中轉運胺基酸和識別密碼子,細胞內每種胺基酸都有其相應的一種或幾種tRNA, 因此tRNA的種類很多,在細菌中約有30~40種tRNA,在動物和植物中約有50~100種tRNA。

1. tRNA一級結構:

tRNA是單鏈分子,含73~93核苷酸,分子質量為24 000~31 000,沉降係數4S。含有10%的稀有鹼基。如二氫尿嘧啶(DHU)、核糖胸腺嘧啶(rT)和假尿苷(ψ)以及不少鹼基被甲基化, 其3』端為CCA-OH,5』端多為pG, 分子中大約30%的鹼基是不變的或半不變的,也就是說它們的鹼基類型是保守的。

2. tRNA二級結構:

tRNA的三葉草型

tRNA二級結構為三葉草型(如右圖)。配對鹼基形成局部雙螺旋而構成臂,不配對的單鏈部分則形成環。三葉草型結構由4臂4環組成。胺基酸臂由7對鹼基組成,雙螺旋區的3』末端為一個4個鹼基的單鏈區-NCCA-OH 3』,腺苷酸殘基的羥基可與胺基酸α羧基結合而攜帶胺基酸。二氫尿嘧啶環以含有2個稀有鹼基二氫尿嘧啶(DHU)而得名,不同tRNA其大小並不恆定,在8-14個鹼基之間變動,二氫尿嘧啶臂一般由3~4對鹼基組成。反密碼環由7個鹼基組成,大小相對恆定,其中3個核苷酸組成反密碼子(anticodon),在蛋白質生物合成時,可與mRNA上相應的密碼子配對。反密碼臂由5對鹼基組成。額外環在不同tRNA分子中變化較大可在4~21個鹼基之間變動,又稱為可變環,其大小往往是tRNA分類的重要指標。TψC環含有7個鹼基,大小相對恆定,幾乎所有的tRNA在此環中都含TψC序列,TψC臂由5對鹼基組成。

3. tRNA的三級結構:

tRNA的三級結構為倒L形

二十世紀七十年代初科學家用X線射衍技術分析發現tRNA的三級結構為倒L形(如右圖)。tRNA三級結構的特點是胺基酸臂與TψC臂構成L的一橫,-CCAOH3』末端就在這一橫的端點上,是結合胺基酸的部位,而二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環共同構成L的一豎,反密碼環在一豎的端點上,能與mRNA上對應的密碼子識別,二氫尿嘧啶環與TψC環在L的拐角上。形成三級結構的很多氫鍵與tRNA中不變的核苷酸密切有關,這就使得各種tRNA三級結構都呈倒L形的。在tRNA中鹼基堆積力是穩定tRNA構型的主要因素。

(二)mRNA

原核生物中mRNA轉錄後一般不需加工,直接進行蛋白質翻譯。mRNA轉錄和翻譯不僅發生在同一細胞空間,而且這兩個過程幾乎是同時進行的。真核細胞成熟mRNA是由其前體核內不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)剪接並經修飾後才能進入細胞質中參與蛋白質合成。所以真核細胞mRNA的合成和表達發生在不同的空間和時間。mRNA的結構在原核生物中和真核生物中差別很大。下面分別作一介紹:

1. 原核生物mRNA結構特點

原核生物的mRNA結構簡單,往往含有幾個功能上相關的蛋白質的編碼序列,可翻譯出幾種蛋白質,為多順反子。在原核生物mRNA中編碼序列之間有間隔序列,可能與核糖體的識別和結合有關。在5』端與3』端有與翻譯起始和終止有關的非編碼序列,原核生物mRNA中沒有修飾鹼基, 5』端沒有帽子結構,3』端沒有多聚腺苷酸的尾巴(polyadenylate tail,polyA尾巴)。原核生物的mRNA的半衰期比真核生物的要短得多,現在一般認為,轉錄後1min,mRNA降解就開始。

2. 真核生物mRNA結構特點

真核生物mRNA為單順反子結構,即一個mRNA分子只包含一條多肽鏈的信息。在真核生物成熟的mRNA中5』端有m7GpppN的帽子結構,帽子結構可保護mRNA不被核酸外切酶水解,並且能與帽結合蛋白結合識別核糖體並與之結合,與翻譯起始有關。3』端有polyA尾巴,其長度為20~250個腺苷酸,其功能可能與mRNA的穩定性有關,少數成熟mRNA沒有polyA尾巴,如組蛋白mRNA,它們的半衰期通常較短。

(三)rRNA的結構

rRNA占細胞總RNA的80%左右,rRNA分子為單鏈,局部有雙螺旋區域具有複雜的空間結構,原核生物主要的rRNA有三種,即5S、16S和23S rRNA,如大腸桿菌的這三種rRNA分別由120、1542和2904個核苷酸組成。真核生物則有4種,即5S、5.8S、18S和28S rRNA, 如小鼠,它們相應含121、158、1874和4718個核苷酸。rRNA分子作為骨架與多種核糖體蛋白(ribosomal protein)裝配成核糖體。

所有生物體的核糖體都由大小不同的兩個亞基所組成。原核生物核糖體為70S,由50S和30S兩個大小亞基組成。30S小亞基含16S的rRNA和21種蛋白質,50S大亞基含23S和5S兩種rRNA及34種蛋白質。真核生物核糖體為80S,是由60S和40S兩個大小亞基組成。40S的小亞基含18S rRNA及33種蛋白質,60S大亞基則由28S、5.8S和5S 3種rRNA及49種蛋白質組成。

(四)其他RNA分子

20世紀80年代以後由於新技術不斷產生,人們發現RNA有許多新的功能和新的RNA基因。細胞核內小分子RNA(small nuclear RNA,snRNA)是細胞核核心蛋白顆粒(Small nuclear ribonucleoprotein particles,snRNPs)的組成成分,參與mRNA前體的剪接以及成熟的mRNA由核內向胞漿中轉運的過程。核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)是類新的核酸調控分子, 參與rRNA前體的加工以及核糖體亞基的裝配。胞質小分子RNA(small cytosol RNA, scRNA)的種類很多,其中7S LRNA與蛋白質一起組成信號識別顆粒(signal recognition particle,SRP), SRP參與分泌性蛋白質的合成,反義RNA(antisense RNA)由於它們可以與特異的mRNA序列互補配對,阻斷mRNA翻譯,能調節基因表達。核酶是具有催化活性的RNA分子或RNA片段。目前在醫學研究中已設計了針對病毒的致病基因mRNA的核酶,抑制其蛋白質的生物合成,為基因治療開闢新的途徑,核酶的發現也推動了生物起源的研究。微RNA(microRNA,miRNA)是一種具有莖環結構的非編碼RNA,長度一般為20-24個核苷酸,在mRNA翻譯過程中起到開關作用,它可以與靶mRNA結合,產生轉錄後基因沉默作用(post-transcriptional gene silencing,PTGS),在一定條件下能釋放,這樣mRNA又能翻譯蛋白質,由於miRNA的表達具有階段特異性和組織特異性,它們在基因表達調控和控制個體發育中起重要作用。

五、RNA組

隨著基因組研究不斷深入,蛋白組學研究逐漸展開,RNA的研究也取得了突破性的進展,發現了許多新的RNA分子,人們逐漸認識到DNA是攜帶遺傳信息分子,蛋白質是執行生物學功能分子,而RNA即是信息分子,又是功能分子。人類基因組研究結果表明,在人類基因組中約有30000~40000個基因,其中與蛋白質生物合成有關的基因只佔整個基因組的2%,對不編碼蛋白質的98%基因組的功能有待進一步研究,為此20世紀末科學家在提出蛋白質組學後,又提出RNA組學。RNA組是研究細胞的全部RNA基因和RNA的分子結構與功能。目前RNA組的研究尚處在初級階段,RNA組的研究將在探索生命奧秘中做出巨大貢獻。  

核酸的相關性質

核酸的性質 (包括化學、物理、以及光譜學和熱力學):

a.化學:

① 酸效應:在強酸和高溫,核酸完全水解為鹼基,核糖或脫氧核糖和磷酸。在濃度略稀的的無機酸中,最易水解的化學鍵被選擇性的斷裂,一般為連接嘌呤和核糖的糖苷鍵,從而產生脫嘌呤核酸。

② 鹼效應

1. DNA:當PH值超出生理範圍(PH7~8)時,對DNA結構將產生更為微妙的影響。鹼效應使剪輯的互變異構態發生變化。這種變化影響到特定鹼基間的氫鍵作用,結果導致DNA雙鏈的解離,稱為DNA的變性

2. RNA:PH較高時,同樣的變性發生在RNA的螺旋區域中,但通常被RNA的鹼性水解所掩蓋。這是因為RNA存在的2`-OH參與到對磷酸脂鍵中磷酸分子的分子內攻擊,從而導致RNA的斷裂。

③ 化學變性:一些化學物質能夠使DNA/RNA在中性PH下變性。由堆積的疏水剪輯形成的核酸二級結構在能量上的穩定性被削弱,則核酸變性。

b.物理:

④ 黏性:DNA的高軸比等性質使得其水溶液具有高黏性,很長的DNA分子又易於被機械力或超聲波損傷,同時黏度下降。

⑤ 浮力密度:可根據DNA的密度對其進行純化和分析。在高濃度分子質量的鹽溶液(CsCl)中,DNA具有與溶液大致相同的密度,將溶液高速離心,則CsCl趨於沉降於底部,從而建立密度梯度,而DNA最終沉降於其浮力密度相應的位置,形成狹帶,這種技術成為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心

c.光譜學:

⑥ 減色性:dsDNA相對於ssDNA是減色的,而ssDNA相對於dsDNA是增色的。

⑦ DNA純度:A260/A280。

d.熱力學:

熱變性:dsDNA與RNA的熱力學表現不同,隨著溫度的升高RNA中雙鏈部分的鹼基堆積會逐漸地減少,其吸光性值也逐漸地,不規則地增大。較短的鹼基配對區域具有更高的熱力學活性,因而與較長的區域相比變性快。而dsDNA熱變性是一個協同過程。分子末端以及內部更為活躍的富含A-T的區域的變性將會使其赴京的螺旋變得不穩定,從而導致整個分子結構在解鏈溫度下共同變性。

復性:DNA的熱變性可通過冷卻溶液的方法復原。不同核酸鏈之間的互補部分的復性稱為雜交。

一、 核酸的大小和測定

一般來說,進化程度高的生物DNA分子應越大,能貯存更多遺傳信息。但進化的複雜程度與DNA大小並不完全一致,如哺乳類動物DNA約為3×109 bp,但有些兩棲類動物、南美肺魚DNA大小可達1010bp到1011bp。

常用測定DNA分子大小的方法有電泳法、離心法。凝膠電泳是當前研究核酸的最常用方法,凝膠電泳有瓊脂糖(agarose)凝膠電泳和聚丙烯醯胺(polyacrylamide)凝膠電泳。

二、核酸的水解

DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學法和酶法水解。在很低pH條件下DNA和RNA都會發生磷酸二酯鍵水解。並且鹼基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解,其中嘌呤鹼的糖苷鍵比嘧啶鹼的糖苷鍵對酸更不穩定。在高pH時,RNA的磷酸酯鍵易被水解,而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。

水解核酸的酶有很多種,若按底物專一性分類,作用於RNA的稱為核糖核酸酶(ribonuclease,RNase),作用於DNA的則稱為脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)。按對底物作用方式分類,可分核酸內切酶(endonuclease)與核酸外切酶(exonuclease)。核酸內切酶的作用是在多核苷酸內部的3』,5』磷酸二酯鍵,有些內切酶能識別DNA雙鏈上特異序列並水解有關的3』,5』磷酸二酯鍵。核酸內切酶是非常重要的工具酶,在基因工程中有廣泛用途。而核酸外切酶只對核酸末端的3』,5』磷酸二酯鍵有作用,將核苷酸一個一個切下,可分為5』→3』外切酶,與3』→5』外切酶。

三、核酸的變性、復性和雜交

(一) 變性

在一定理化因素作用下,核酸雙螺旋等空間結構中鹼基之間的氫鍵斷裂,變成單鏈的現象稱為變性(denaturation)。引起核酸變性的常見理化因素有加熱、酸、鹼、尿素甲醯胺等。在變性過程中,核酸的空間構象被破壞,理化性質發生改變。由於雙螺旋分子內部的鹼基暴露,其A260值會大大增加。A260值的增加與解鏈程度有一定比例關係,這種關係稱為增色效應(hyperchromic effect)。如果緩慢加熱DNA溶液,並在不同溫度測定其A260值,可得到 「S」形DNA熔化曲線(melting curve)。從DNA熔化曲線可見DNA變性作用是在一個相當窄的溫度內完成的。

當A260值開始上升前DNA是雙螺旋結構,在上升區域分子中的部分鹼基對開始斷裂,其數值隨溫度的升高而增加,在上部平坦的初始部分尚有少量鹼基對使兩條鏈還結合在一起,這種狀態一直維持到臨界溫度,此時DNA分子最後一個鹼基對斷開,兩條互補鏈徹底分離。通常把加熱變性時DNA溶液A260升高達到最大值一半時的溫度稱為該DNA的熔解溫度(melting temperature Tm),Tm是研究核酸變性很有用的參數。Tm一般在85~95℃之間,Tm值與DNA分子中G C含量成正比。

(二) 復性

變性DNA在適當條件下,可使兩條分開的單鏈重新形成雙螺旋DNA的過程稱為復性(renaturation)。當熱變性的DNA經緩慢冷卻後復性稱為退火(annealing)。DNA復性是非常複雜的過程,影響DNA復性速度的因素很多:DNA濃度高,復性快;DNA分子大復性慢;高溫會使DNA變性,而溫度過低可使誤配對不能分離等等。最佳的復性溫度為Tm減去25℃,一般在60℃左右。離子強度一般在0.4mol/L以上。

(三) 雜交

具有互補序列的不同來源的單鏈核酸分子,按鹼基配對原則結合在一起稱為雜交(hybridization)。雜交可發生在DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA之間。雜交是分子生物學研究中常用的技術之一,利用它可以分析基因組織的結構,定位和基因表達等,常用的雜交方法有Southern印跡法,Northern印跡法和原位雜交(insitu hybridization)等。  

核酸的變性和復性

變性(denaturation)和復性(renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特性。也是核酸研究中經常引用的術語。雙鏈DNA,RNA雙鏈區,DNA: RNA雜種雙鏈(hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子(heteroduplex) 都具有此性質。

(1)DNA的變性:

指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。確切地就是維持雙螺旋穩定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的,是可逆的或是非可逆的。DNA變性不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素都可以成為變性的條件,如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇乙醇、尿素及甲醯胺等,均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。變性能導致DNA 以下一些理化及生物學性質的改變。

溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的"剛性"結構,變性後代之以「柔軟」 而鬆散的無規則單股線性結構,DNA粘度因此而明顯下降。

溶液旋光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變, 使DNA溶液的旋光性發生變化。

增色效應或高色效應(hyperchromic effect)。指變性後DNA 溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子具有吸收250-280nm波長的紫外光的特性,其吸收峰值在260nm。DNA分子中鹼基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎,但雙螺旋結構有序堆積的鹼基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開,鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收,故而產生增色效應。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀測此效應的指標,變性後該指標的觀測值通常較變性前有明顯增加, 但不同來源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經熱變性後,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來源的DNA溶液的增值範圍多在20-30%之間。

以加熱為變性條件時,增色效應與溫度有十分密切的關係,這主要是變性溫度取決於DNA自身的性質。熱變性使DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature,簡寫Tm)。因熱變性是在很狹的溫度範圍內突發的躍變過程, 很像結晶達到熔點時的熔化現象,故名熔解溫度。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型。S型曲線下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時,次級鍵突發斷開,DNA迅速解鏈,同時伴隨吸光率急劇上升,此後因"無鏈可解"而出現溫度效應喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測DNA的50%發生變性的意義,即增色效應達到一半的溫度作為Tm,它在S型曲線上,相當於吸光率增加的中點處所對應的橫坐標。不同來源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義,首先是指DNA分子中鹼基組成的均一性,如人工合成的只含有一種鹼基對的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值範圍就較窄。因前者在變性時的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進行,故所要求的變性溫度更趨於一致。其次還包含有待測樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值範圍較窄, 若混雜有其它來源的DNA,則Tm值範圍較寬。其原因顯然也與DNA的鹼基組成有關。 總的說,DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值範圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下,Tm值的高低取決於DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C鹼基對越多,Tm值越高。此點是易於理解的,因G-C鹼基對具有3對氫鍵,而A-T鹼基對只有2對氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強結構的穩定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實驗說明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著密切相關性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分數的這種關係可用以下經驗公式表示(DNA溶於0.2mol/L NaCl中):

X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)

(2)DNA的復性:

指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為" 退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡要說明之。

溫度和時間。變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特徵可以基本恢復到第一次變性曲線的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動顯著減弱互補鏈結合的機會自然大大減少。從熱運動的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利於復性。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。

DNA濃度。復性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用「成核」。這一過程進行的速度與DNA濃度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多,相互碰撞結合「成核」的機會越大。

DNA順序的複雜性。簡單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時,互補鹼基的配對較易實現。而順序複雜的DNA,如小牛DNA的非重複部分,一般以單拷貝存在於基因組中,這種複雜特定序列要實現互補,顯然要比上述簡單序列困難得多。在核酸復性研究中,定義了一個Cot的術語,(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時間),用以表示復性速度與DNA 順序複雜性的關係。在探討DNA順序對復性速度的影響時,將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)取對數後對Cot作圖,可以得到如圖所示的曲線,用非重複鹼基對數表示核酸分子的複雜性。如多聚(A)的複雜性為1,重複的(ATGC)n組成的多聚體的複雜性為4,分子長度是105核苷對的非重複DNA的複雜性為105。原核生物基因組均為非重複順序,故以非重複核苷酸對表示的複雜性直接與基因組大小成正比,對於真核生物基因組中的非重複片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度,400核苷酸的長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cotl/2),與核苷酸對的複雜性成正比。對於原核生物核酸分子,此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的複雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重複序列(repetitive sequence),所得到的Cot曲線要上圖中的S曲線複雜。

(3)核酸分子雜交

分子雜交(簡稱雜交,hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗技術。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質,使來源不同的DNA(或RNA)片段,按鹼基互補關係形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質就是在一定條件下使互補核酸鏈實現復性(加熱或鹼處理)使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術也是核酸雜交的一個環節。

若雜交的目的是識別靶DNA中的特異核苷酸序列,這需要牽涉到另一項核酸操作的基本技術─探針(probe)的製備。探針是指帶有某些標記物(如放射性同位素32P,熒光物質異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。若我們設法使一個核酸序列帶上32P,那麼它與靶序列互補形成的雜交雙鏈,就會帶有放射性。以適當方法接受來自雜交鏈的放射信號,即可對靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別。在現代分子生物學實驗中,探針的製備和使用是與分子雜交相輔相成的技術手段。核酸分子雜交作為一項基本技術,已應用於核酸結構與功能研究的各個方面。在醫學上,目前已用於多種遺傳性疾病的基因診斷(gene diagnosis),惡性腫瘤的基因分析,傳染病病原體的檢測等領域中,其成果大大促進了現代醫學的進步和發展。  

核酸的相關評論

核酸、蛋白質誰更「牛」?

一般人都知道,生命是蛋白質存在的形式,蛋白質是生命的基礎。在發現核酸前,這句話是 對的,但當核酸被發現後,應該說最本質的生命物質是核酸,或是把上述的這句話更正為蛋白體是生命的基礎。按照現代生物學的觀點,蛋白體是包括核酸和蛋白質的生物大分子。

核酸在生命中為什麼比蛋白質更重要呢?因為生命的重要性是能自我複製,而核酸就能夠自 我複製。蛋白質的複製是根據核酸所發出的指令,使胺基酸根據其指定的種類進行合成,然後再按指定的順序排列成所需要複製的蛋白質。世界上各種有生命的物質都含有蛋白體,蛋 白體中有核酸和蛋白質,至今還沒有發現有蛋白質而沒有核酸的生命。但在有生命的病毒研究中,卻發現病毒以核酸為主體,蛋白質和脂肪以及脂蛋白等只不過充作其外殼,作為與外 界環境的界限而已,當它鑽入寄生細胞繁殖子代時,把外殼留在細胞外,只有核酸進入細胞內 ,並使細胞在核酸控制下為其合成子代的病毒。這種現象,美國科學家比喻為人和汽車的關 系。即把核酸比為人,蛋白質比作汽車,入駕駛汽車到處跑,外表上看,人車一體是有生命運動的東西,而真正的生命是人,汽車只是由人製造的載入的外殼。近來科學家還發現了一 種類病毒,是能繁殖子代的有生命物體,其中只有核酸而沒蛋白質,可見核酸是真正的生命物質。

因此我國1996年最新出版的《人體生理學》改變了舊教科書中只提蛋白質是生命基礎的缺陷 ,明確提出:「蛋白質和核酸是一切生命活動的物質基礎。」

然而,多少年來,人們在一味追求蛋白質、維生素微量元素等營養時,卻把最重要的角色 ——核酸忘卻了,這不能不說是人類生命史上的一大遺憾。

沒有核酸,就沒有蛋白,也就沒有生命。

然而遺憾的是,從目前的分析來看,人類無法從食物中直接攝取核酸.人體細胞內的核酸都是自己合成的.服用核酸對人體而言根本毫無營養價值,相反,有研究發現,過度攝入核酸會造成腎結石等疾病.

人造核酸可用於治療白血病

日本工業技術院產業技術融合領域研究所在8月3日出版的《自然》雜誌上發表論文稱,已開發出了治療白血病的人造核酸。這種人造核酸就像一把剪刀,可發現引起白血病的遺傳基因並將其剪除。科研小組的成員、東京大學研究生院教授多比良和誠根據動物實驗結果認為,這種人造核酸將來有望成為治療白血病的主要藥物。

這次研究的對象是慢性骨髓性白血病(MCL),患者的異常遺傳因子是由兩個正常的遺傳因子連接而成的,新開發的人造核酸可以發現這種變異遺傳基因並將其切斷。科學家過去也發現過能找到特定的遺傳因子序列並將其切斷的分子,但在切斷特定遺傳因子序列的同時往往對正常細胞造成傷害。而新開發出的核酸只在發現異常遺傳因子時才被激活,平時則潛伏不動。

科研小組用人體白血病細胞進行了動物實驗。他們將可與人造核酸反應的細胞和不可與人造核酸反應的細胞分別注射到8隻實驗鼠的體內。移植後第13周時,不與人造核酸反應的細胞全部死亡,而與人造核酸反應的細胞全部存活,證明人造核酸在生物體內十分有效。

科研小組說,此人造核酸的臨床應用尚有諸多問題要解決,將來很可能是把患者的骨髓細胞抽出來,經人造核酸處理後,再把正常細胞的骨髓輸回患者體內。

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