電泳法

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電泳法】是指帶電荷的供試品(蛋白質核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等)中,於電場的作用下,向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄的區帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其含量(%)的方法。

【分類】

● 1.紙電泳法

操作法 (1) 電泳緩衝液 枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7.H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7.2H2O4.12g,加水4000ml,使溶解。

(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低於4,置60℃烘箱烘乾,備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙,或根據電泳室的大小裁剪,並在距長度方向一端5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm處做一記號備點樣用。 

(3) 點樣 有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)中,濕潤後,取出,用濾紙吸干多餘的緩衝液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩衝液中,然後用微量注射器精密點加供試品溶液,每10μl,共3點,並留2個空白位置;干點法是將供試品溶液點於濾紙上,吹乾、再點,反覆數次,直至點完規定量的供試品溶液,然後用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最後噴濕,本法適用於稀的供試品溶液。

(4) 電泳 於電泳槽中加入適量電泳緩衝液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩壓電源檔,調整電壓梯度為18~20V/cm,電泳約1小時45分鐘,取出,立即吹乾,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆划出紫色斑點的位置。

(5) 含量測定 剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙,剪成細條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時,用3號垂熔玻璃漏斗濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項下的規定測定吸收度,並按吸收係數計算含量。

● 2.醋酸纖維素薄膜電泳

操作法

(1) 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜,裁成2cm×8cm的膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾於濾紙中,輕輕吸去多餘的緩衝液後,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中。

(2) 點樣與電泳 於膜條上距負極端2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在10~12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4~5cm為宜。

(3) 染色 電泳完畢,將膜條取下浸於氨基黑染色液中,2~3分鐘後,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色止止。

(4) 透明 將洗淨並完全乾後的膜條浸於透明液中10~15分鐘,取出平鋪於潔淨的玻板上,干後即成透明薄膜,可於分光光度計上測定和作標本長期保存。

(5) 含量測定 未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定,一般採用洗脫法或掃描法,測定各蛋白質組分的相對含量(1%)。

● 3.瓊脂糖凝膠電泳

操作法

(1)制膠 取瓊脂糖約0.2g,加水10ml,置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸-鋰鹽緩衝液(pH3.0)10ml,混勻,趁熱將膠液塗佈於大小適宜(2.5cm×7.5cm

或4cm×9cm)的玻板上,厚度約3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。

(2) 標準品溶液及供試品溶液的製備 照各藥品項下規定配製。

(3) 點樣與電泳 在電泳槽內加入醋酸-鋰鹽緩衝液(pH3.0),將凝膠板置於電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板負極端分別點樣1μl,立即接通電源,在電壓梯度約30V/cm、電流強度1~2mA/cm的條件下,電泳約20分鐘,關閉電源。

(4) 染色與脫色 取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液染色,用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。

● 4.聚丙烯醯胺凝膠電泳

操作法

(1)制膠 取溶液A2ml,溶液B5.4ml,加脲2.9g使溶解,再加水4ml,混勻,抽氣趕去溶液中氣泡,加0.56%過硫酸銨溶液2ml,混勻製成膠液,立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10cm×0.5cm)中,使

膠層高度達6~7cm, 然後徐徐滴加水少量,使覆蓋膠面,管底氣泡必須趕走,靜置約30分鐘,待出現明顯界面時即聚合完畢,吸去水層。

(2)標準品溶液及供試品溶液的製備 照各藥品項下的規定。

(3)電泳 將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內,每管加供試品或標準品溶液50~100μl,為防止擴散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚藍指示液1滴,也可直接在上槽緩衝液中加0.04%溴酚藍指示液數滴,玻璃管的上部用電極緩衝液充滿,上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA,數分鐘後,加大電流使每管為2~3mA,當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處,關閉電源。

(4)染色和脫色 電泳完畢,用裝有長針頭並吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入,膠條即從管內滑出,將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10~30分鐘,以水漂洗乾淨,再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。

(5)結果判斷 將膠條置燈下觀察,根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分,由各組分的峰面積計算含量(1%)。

● 5.SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法

操作法

(1)制膠 用30%丙烯醯胺溶液-分離膠緩衝液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液(新鮮配製)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)製成分離膠液,灌入模具內至一定高度(剩餘體積留作製備濃縮膠用),用水封頂,聚合完畢,傾去水層。再用30%丙烯醯胺溶液-濃縮膠緩衝液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)製成濃縮膠液,灌在分離膠上,插入樣品梳(如為圓盤電泳,用水封頂),待濃縮膠液聚合後,小心除去樣品梳或水。

(2)對照品和供試品溶液的製備 照各藥品項下的規定。

(3)電泳 垂直板電泳:恆壓電泳,初始電壓為80V,進入分離膠時調至150~200V,當溴酚藍遷移膠底處,停止電泳。

(4)用卡尺或用掃描定位法測量溴酚藍指示劑和蛋白遷移距離(如為圓盤電泳還應測量染色前後膠條長度,垂直板電泳膠片厚度低於1mm,染色前後膠片長度基本不變)。計算相相對遷移率:分子量 以R'<[m]>為橫坐標,標準蛋白的分子量對數為縱坐標,進行線性回歸,由標準曲線求得供試品的分子量。;純度 取膠片(條),置薄層掃描儀,以峰面積按歸一化法計算;結果判斷 供試品主成分遷移率應與對照品遷移率一致。

電泳緩衝液的作用是什麼

緩衝液在電泳過程中的作用是維持合適的pH。電泳時的正極與負極都會發生電解反應,正極發生的是氧化反應,負極發生的是還原反應。長時間的電泳將使正極變酸,負極變鹼。一個好的緩衝系統應有較強的緩衝能力,是溶液兩極的pH保持基本不變。

電泳緩衝液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性,以利於DNA分子的遷移,例如,一般電泳緩衝液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子,Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢;太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。

電泳緩衝液還有一個組分是EDTA(乙二胺四乙酸),加入濃度為1-2mmol/L,目的是螯合Mg2+ 電漿,防止電泳時激活 DNA酶,此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉澱。

此外,我們常常用「電泳法」判斷液體的性質,是膠體還是溶液。在高中化學中我們就用過這種方法判斷給定的液體是否為膠體。

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