凝膠

跳轉到: 導航, 搜索

袋裝凝膠

gel ning jiao

又稱凍膠。溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接,形成空間網狀結構,結構空隙中充滿了作為分散介質的液體(在干凝膠中也可以是氣體),這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達99%以上。可分為彈性凝膠和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質後,體積顯著縮小,而當重新吸收分散介質時,體積又重新膨脹,例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質時,形狀和體積都不改變,例如矽膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過程稱為膠凝作用(gelation)。  

目錄

生物學和凝膠

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗抗體抗原類、病毒核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理化學特性,然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。

1.測定——分子量、PI

當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時,可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離範圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩衝液試管中,可簡易地測出PI,並選擇純化用緩衝液的最佳PH.

2.選擇——層析方法

若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解,可嘗試幾種不同的純化方法:

一] 使用最通用的凝膠過濾方法,選擇分離範圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將 樣品分成不同組份。

二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物受體等自製親和介質,再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。

三] 體積大的樣品,往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品,可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理,洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。

3.純化——大量粗品

處理大量原液時,為避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質,直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率,縮短純化周期。

4.純化——硫酸氨樣品 硫酸氨沉澱方法常被用來初步淨化樣品,經處理過的樣本處於高鹽狀態下,很適合直接上疏水層析。若作離子交換,需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術,隨著介質種類不斷增多,漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。

5.純水——糖類分子

固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥凝集素,可結合碳水化合物的糖類殘基,很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器,純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質,專為俘獲整個細胞或大複合物,如膜囊等。

6.純化——膜蛋白

膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者,避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質,籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。

7.純化——單抗、抗原 *單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。腹水有大量白蛋白轉鐵蛋白宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區有專一性親和作用,能一步純化各種不同源的IgG.血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理,在培養前除去IgG.重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性,基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200,很容易去除。

8.純化——重組蛋白 重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物,擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。

一] GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達,然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化,再利用凝血酶或因子Xa切開。

2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達,以IgG Sepharose 6 FF純化。

二] 含組氨酸標記(Histidine-tagged)的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬,在一般或變性條件(8M尿素)下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。

9.純化——包涵體蛋白

包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學穩定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質很適合在變性條件下做純化。變性純化後的蛋白需要復性至蛋白的天然構象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發現有助包涵體蛋白的復性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高,復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品,並可以1MnaOH重生。此方法純化後的包涵體蛋白,復性回收率明顯提高。

10.包涵體蛋白固相復性 *近年許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定(吸附)在層析介質上,一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。去除變性劑後,蛋白在介質上成功復性,再將復性好的蛋白洗脫下來。固相復性避免了一般復性過程中蛋白質聚體的形成,所以復性得率更高,而且無需大量稀釋樣品,並將復性和初純化合二為一,大大節省時間及提高回收率。

11.純化——中草藥有效成分

中藥的化學成分極其複雜。傳統中藥多是煎熬後服用,有效成份多較為親水,包括生物鹼、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析,更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能,例:如用甲醇分離黃酮甙,三糖甙先被洗下來,二糖甙其次,單糖甙隨後,最後是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮氯仿等各種試劑,廣泛用於各種天然產物的分離,包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。

12.純化——肽類

肽類的來源有天然萃取,合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解,但可從有機溶劑或促溶劑中復性,所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱,能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子製備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能

13.純化——核酸、病毒

核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質體DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子,和質體DNA一樣,可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白,再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。

14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸多應用在反義(anti-sense)DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成後含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物,並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析,可用做大量製備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。

15.脫鹽、小分子去除

使用凝膠過濾介質Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,處理量可達床體積30%.只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液,就可以去除該填料分離範圍上限以下的小分子,簡單直接。由於只是去除小分子,柱高10cm以上即可。整個過程一般可於數分鐘至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計,預裝柱HiTrap Desalting(5ml)可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鐘為多至10ml樣品脫鹽。

16.疫苗純化 使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗,去除培養基中的雜蛋白,處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm,整個過程約半至一小時。目前使用此法生產的疫苗品種有B肝狂犬出血熱流感肺結核小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR,如A肝疫苗等。

17.抗生素聚合物分析

中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比,規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。

18.純化-基因治療病毒載體

SORRCE 15Q

19.純化-基因治療用質體

Q Sepharose XL,SOURCE 15Q,STREAMLINE Q,Sephacryl S500,Plasmidselect 在下游純化中,可應用不同層析技術在純化生物分子的同時,去除各種污染物。  

去除病毒

1.去除——內毒素

內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白,是帶負電的複合大分子。

內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集,無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒(17-1349-01)可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。

內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白後用高鹽緩衝液或NaOH去除。

利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL,PMB,自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體,凝膠過濾層析可有效地將之去除。

2.去除——蛋白中的核酸

大量核酸增加樣本黏度,令區帶擴張,反壓增加,降低解析度和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。

胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷,在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP,SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL結合目標蛋白,可除去大量核酸。

核酸在高鹽下會和蛋白解離,疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白,在純化蛋白的同時去除核酸。

利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。

3.去除——病毒和微生物

病毒和微生物可成為病原,應盡量減除。結合不同層析技術,使用注射用水,用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗,皆可避免污染物增加。

病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D(solvent/detergent)處理,使病毒失活,如Triton和Tween.再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白,去除S/D.

其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活,凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質,SOURCE都是很好的精細純化介質,可去除多種微量污染物。  

凝膠作用(凍膠)

凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠,在適當的條件下,整個體系會轉變成一種彈性的半固體狀態的稠厚物質,失去流動性。這種現象稱為膠凝作用,所形成的產物叫做凝膠凍膠.

「氣凝膠」是指分散係為氣態的,如:雲,霧等,「固凝膠」有煙水晶等,「液凝膠」就是呈液態的膠體,如氫氧化鐵膠體 。  

舉例:

食品級葡甘露膠(Gum Konjac-GM)

葡甘露膠(又稱:魔芋膠)系一種新型多用途微粒狀可食用膠。這裡推出之葡甘露膠是以優質魔芋中提取的葡萄甘露聚糖為原料,經脫雜處理後採用先進技術加工而成,其中添加成分不含任何非食用化學配料或色素。與傳統的瓊脂、果膠海藻膠等食品添加劑相比,葡甘露膠在膨脹率、粘度、增稠、穩定性及使用方便程度上皆顯著優於上述膠類,此外尚具有特殊的優點:無需添加任何凝固劑,在無糖、低糖或高糖條件下,在酸性、中性或鹼性條件下,常溫即可凝凍,凝膠性能理想;保持或強化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、減肥等保健功能,大大拓寬了魔芋應用的範圍;價格低廉、使用方便。

葡甘露膠能廣泛用於食品、飲料、醫藥、日用化工、科研等領域,作為瓊脂、果膠、海藻膠等的替代產品,價格低廉,且使用時無需改變原有的設備及工藝,能大幅度降低添加劑的使用成本,是一種理想的新型凝膠添加劑。為滿足不同產品開發的需要,  

一、凝膠(果凍)型:

能與各種天然果汁、物料及色素良好混合,作為廣譜凝膠賦型劑,是製作果凍、水晶軟糖等的極佳原料,也可作為培養基支持體,且不需再添加其它任何膠類或鹼性成份;凝膠成型條件隨意、脫杯完整,凝膠強度高、韌性大。 用量:0.7~0.9%。用法:在適量溫水中溶脹3~5分鐘,煮沸冷至70度左右時加入糖及各種配料,冷卻至室溫即成。  

二、培養基型:

用作替代瓊脂作為花卉及其它植物進行組織培養的支持體。組培苗根粗、苗壯,使用效果理想,成本大幅降低。用量:0.5~0.6%。用法:在溫水中溶脹3~5分鐘,煮沸後冷卻即可。 三、果肉(茶)飲料型:作為穩定劑與懸浮劑,替代瓊脂和羧甲基纖維素等,廣泛用於粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、銀耳羹、八寶粥等異相懸浮劑等(或混合)飲料中,防止沉澱或分層。 用量:0.15~0.25%左右。用法:在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。 四、冷凍製品型:用於冰棒、冰淇淋等各種冷凍製品,可增大膨脹,減少冰晶,提高抗熱融性,使產品更加爽口。 用量:0.15~0.25%左右。用法:在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。 五、增稠型:用於果醬、米、面製品中,可增大膨脹率,提高韌性,改善賦型和口感。是進口洋槐豆膠的理想替代物。 用量:0.2~0.3%左右。用法:在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。  

凝膠糖果

在凝膠糖果生產製造中,怎樣才能夠合理使用復配膠呢?  

製作過程

首先,我們應該弄清相關的凝膠糖果製造的基本機理和凝膠劑之間的協同增效作用;其次是如何選擇具有協同增效作用的凝膠劑進行合理的復配。否則,只將會事倍功半,甚至於會產生凝膠劑之間的拮抗作用,阻礙凝膠的形成,也就談不上凝膠糖果的生產製造。

凝膠糖果可以看作是一種糖果溶液的凝膠體,而凝膠體的形成取決於凝膠劑的水合作用。因此,所有用於糖果的凝膠劑都必須是親水性的膠體,當膠體分子的親水基(-OH,-COOH等),吸持一定量的水份而形成水合作用,水作為溶劑分子復蓋其上形成水化層,同時,膠體分子的非親水基(-CH3、-CH2等)產生分子間的相互吸引力。有助於將單一膠粒形成線狀分子並進而聚集成束狀膠團。當凝膠從溶膠狀態轉為凝膠狀態時,個別膠粒失去隨意行動的能力,膠團與膠團之間開始結合成許多長鏈,長鏈逐漸相互交錯,無定向地組成結,組成帶和組成網,構成複雜的三維網路,構成了凝膠體的極為複雜的組織骨架,由於網路交界處形成很多空隙,並吸附大量的水分子,體積也隨之膨脹變大,在一定條件下形成一種柔嫩、透明、光滑的凍膠狀態,此時系統內的膠粒隨意運動的傾向將會明顯減弱,隨著體系內水分子的進一步擴散,膠體的水化部位發生變化,其中部份膠束呈現定向的排列,並呈晶體結構,膠體間的緊密結合,凍膠狀態又會逐漸變成凝膠狀態。如果在形成凝膠狀態的時候,我們將熬煮濃縮成一定濃度的糖漿加入,則糖類物質——多種碳水化合物的濃縮糖漿均勻地填滿充實在凝膠錯綜複雜的網路空隙里,並使之固定化下來,從而形成一種非常穩定的含糖的凝膠。即使給予它較大的外來壓力,也不會將其糖分子或水分子析出。如果我們再將其放置在一定的溫、濕度的環境中,讓體系內水分子進一步擴散、逃逸、蒸發。我們將得到的是質構非常堅固與緊密的含糖的凝膠體——凝膠糖果。  

不同凝膠糖果的製造差別

不同的凝膠糖果的製造,其影響因素,工藝條件很多,成因又非常的複雜,這主要是因為不同凝膠劑的類型,分子結構,物理化學的性質都有很大的差異,不同的凝膠糖果的物料組成及其應用比例又各不相同,特別是選用兩種或多種不同的凝膠劑來製造凝膠糖果。我們更需要弄清楚它們配伍之後會產生怎樣的作用,是疊加協同增效作用;還是疊加減效拮抗作用?所以,我們在復配不同凝膠劑之前,應該弄清楚相關凝膠劑的特性,分子結構,然後再根據我們製造凝膠糖果所需要的工藝要求加以選擇。優選復配膠的最佳組合和它們最佳的組合比例。

現以瓊脂凝膠糖果為例。在許多的凝膠劑中,槐豆膠、角豆膠、黃原膠和明膠均與瓊脂之間存在著協同增效作用。只是它們的增效程度和最佳添加比例範圍不同,而瓜爾膠和果膠都與瓊脂之間會產生拮抗作用。這主要是由於它們的分子結構所決定的。槐豆膠、角豆膠都是半乳甘露聚糖構成,以甘露糖殘基為主鏈,平均每隔4個毗鄰的甘露糖殘基就連接一個半乳殘基支鏈,但支鏈傾向於連接在一系列連續的甘露糖殘基上形成「手發鏈段」和「光禿鏈段」,與瓊脂雙螺旋結合,交聯,產生疊加增效效應。瓜爾膠雖然也是半乳糖殘基,側鏈密而短,不能與瓊脂分子交聯,反而會阻礙瓊脂分子交聯。果膠則是因為屬直鏈高分子化合物,無明顯的側鏈基因,故無法與瓊脂分子交聯,反而會阻礙瓊脂分子形成凝膠。在我們製造凝膠糖果過程中,選擇哪些凝膠來進行復配就能起著協同增效效應,發揮各自優勢,起著互補相襯的作用呢?除上述的瓊脂凝膠糖果的實例外,據有關文獻資料介紹,卡拉膠與槐豆膠按3:1~1:3的比例進行復配,可以提高、改善凝膠的強度和結構外,還能增強克服脫液收縮的現象,明膠與黃原膠,結冷膠合理復配,可以增強明膠糖果的彈性,提高其透明度,更為重要是可以添加果酸而不破壞其質構,大大改善明膠凝膠糖果的風味。在澱粉型糖果配料中,如果添加0.05%的黃原膠,可以改進加工性能,即在熬煮好混合糖液後,便可以立即急劇冷卻成凝膠,大大縮短了凝膠形成時間,為改變傳統的烘房乾燥工藝創造了良好的條件。如果將明膠和魔芋甘露膠按3~4:1進行復配製造凝膠糖果,則可製得口感柔潤、咀嚼性好,富有彈性,更光亮透明的明膠凝膠糖果。  

非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)

Native-PAGE原理

非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下, 對保持活性的蛋白質進行聚丙烯醯胺凝膠電泳,常用於同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的解析度,尤其是在電泳分離後仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性,對於生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳後將凝膠切成兩半,一半用於活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用於所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。  

實驗方法

非變性聚丙烯醯胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的,只是非變性聚丙烯醯胺凝膠的配製和電泳緩衝液中不能含有變性劑如SDS等。

一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是鹼性還是酸性蛋白。分離鹼性蛋白時候,要利用低pH凝膠系統,分離酸性蛋白時候,要利用高pH凝膠系統。

酸性蛋白通常在非 變性凝膠電泳中採用的pH是8.8的緩衝系統,蛋白會帶負電荷,蛋白會相陽極移動;而鹼性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白。  

工作液配製

1.40%膠貯液(Acr:Bis=29:1);

2.4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8):18.2 g Trisbase 溶於ml 水,用濃HCl調pH 8.8,加水定容到100ml,4℃貯存;

3. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8):6g Trisbase 溶於80ml 水,用濃HCl調pH 6.8,加水定容到100ml,4℃貯存;

4.10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase, 144g 甘氨酸,加水定容到L,4℃貯存;

5.2×溴酚藍上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl,3.0ml甘油,.2ml 0.5% 溴酚藍,5.5ml dH2O; -20℃貯存;

6. 10%APS;

7. 0.25%考馬斯亮藍染色液:Coomassie blue R-250 2.5g,甲醇ml,HAc 100ml, dH2O 450ml;

8.考馬斯亮藍脫色液:100ml甲醇,100冰醋酸,800ml dH2O

電泳膠的配製及電泳條件(上槽電極為負,下槽電極為正)

1. 鹼性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)

2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C) 4.25ml 0.5ml

3. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml

4. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8) 1.25ml

5. 水 3.2ml

6. 10%APS 35ul

7. TEMED 15 ul

8. 10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):100ml稀釋到L

電泳條件:100V恆壓約20min,指示劑進入濃縮膠;改換160V恆壓,當指示劑移動到膠板底部時,停止電泳,整個過程約80min。

染色和脫色:取出膠板於0.25%考馬斯亮藍染色液中染色約30min,傾出染色液,加入考馬斯亮藍脫色液,緩慢搖動,注意更換脫色液,直至膠板乾淨清晰背景。也可以用銀染或者活性染色。

分離鹼性蛋白

要用低pH凝膠系統,並使用以下緩衝液體系:

1. 分離膠:0.06M KOH,0.376M Ac,pH4.3(7.7% T,2.67% C);

2. 堆積膠:0.06M KOH,0.063M Ac,pH6.8(3.125% T,25% C);

3. 電泳緩衝液:0.14M 2-丙氨酸,0.35M Ac,pH4.5

將正負電極倒置,用甲基綠(0.002%)為示蹤劑

實驗操作同分離酸性蛋白。  

SDS-PAGE和Native-PAGE的比較

非變性凝膠電泳,也稱為天然凝膠電泳,與非變性凝膠電泳最大的區別就在於蛋白在電泳過程中和電泳後都不會變性。最主要的有以下幾點:

1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS,而變性凝膠的有SDS。

2. 電泳載樣緩衝液中非變性凝膠的不僅沒有SDS,也沒有巰基乙醇。

3. 在非變性凝膠中蛋白質的分離取決於它所帶的電荷以及分子大小,不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離只與其分子量有關。

4. 非變性凝膠電泳中,酸性蛋白和鹼性蛋白的分離是完全不同的,不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中鹼性蛋白通常是在微

酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。

5. 因為是非變性凝膠電泳,所有的電泳時候電流不能太大,以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性,而且步驟都要在0-4度的條件下進行,這樣才可以保持蛋白質的活性,也可以降低蛋白質的水解作用。這點跟變性電泳也不一樣。

所以與SDS-PAGE電泳相比,非變性凝膠大大降低了蛋白質變性發生的機率。  

問題和解答

1. 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時預電泳是怎麼回事的?預電泳時要加6×DNA上樣緩衝液嗎?電泳1-2小時再加結合反應產物嗎?

預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑,提高解析度,不加任何物質,一般30-60分鐘後加樣電泳。

2. 銀染的步驟是什麼?銀染的關鍵因素是什麼?

步驟是:

(1) 固定:10%冰乙酸min。

(2) 清洗:雙蒸水沖洗凝膠次,每次min。

(3) 染色:染色液(1g硝酸銀,.5mL37%甲醛,1L雙蒸水。現配)染色30min。

(4) 清洗:迅速洗凝膠次。

(5) 顯影:30g碳酸鈉,1.5mL37%甲醛,200uL 10mg/L硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現。

成功銀染的關鍵因素包括:

(6) 用超純水(比如,NANOpure或Milli-Q純化)或者是雙蒸水作銀染。

(7) 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉。

(8) 在染色後,水清洗所用時間的長短很重要,用不超過5-10秒的時間清洗膠,然後放入顯色溶液中,一般在水裡浸一下就好。

(9) 甲醛和硫代硫酸鈉(ul/1ml)在使用前,及時加入到顯色液中。

(10) 在使用前及時配染色液。

3. 變性PAGE的上樣緩衝液配方?如何準備上樣的蛋白?是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用於非變性

PAGE的裂解液.具有操作步驟是什麼?

非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩衝液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可,甘油是主要的沉澱作用成分。都可以自己

配。細胞超聲即可,超聲後離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋

白多聚體穩定的因素。

4. 做了naive---PAGE沒有條帶,蛋白質是純品,分子量很大,怎麼回事呢?

因為分子量很大,8%的膠濃度較合適。加樣時加個marker,可以檢測膠製備是否有問題。銀染方法比較靈敏,如果蛋白是一種酶,且可使某種底物顯色的話,可以用活性染色試試,更靈敏。  

Native-PAGE注意幾個問題

1. 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳的過程中,蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關,還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關,其中蛋白質的等電點是最重要

的影響因子,要根據蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩衝系統;

2. 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳的過程中,要注意電壓過高引起發熱而導致蛋白質變性,所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度;

3. 蛋白質的分子量較大,則電泳時間可以適當延長,以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開,反之亦然;

4. 變性樣品的離子強度不能太高(I<0.1mM)。調整樣品的PH在4.0左右,這對於能否做好非變性樣品非常重要。上樣BUFFER 中沒有SDS之外,加入樣品後不能加熱.  

蘆薈凝膠

從多年生百合蘆薈葉的肉汁部分所得的液汁(經提純加工),  

成分

主要有蘆薈大黃素,蘆薈蒽酮,多種糖類、酶、胺基酸等組成。為淡黃綠色液體,相對密度為0.98~1.02,pH值4~6。  

用途

主要用於化妝品(完美蘆薈膠)中的皮膚頭髮保護用品,具有保濕、防晒、防臭、防肥胖、軟化皮膚,消炎止癢,防粉刺雀斑等功效。也可用於醫藥和食品中。  

氣凝膠(aerogels)

氣凝膠(aerogels)沒有明確而固定的定義,氣凝膠通常是指以奈米量級超微顆粒相互聚集構成奈米多孔網路結構,並在網路孔隙中充滿氣態分散介質的輕質奈米固態材料。

美國史丹福大學的S.S.Kistler首先用水玻璃通過溶膠-凝膠方法及超臨界乾燥技術製得SiO2氣凝膠。

按其組分,可分為單組分氣凝膠,如SiO2,Al2O3,TiO2,炭氣凝膠(有機氣凝膠炭化後得到)等;多組分氣凝膠,如SiO2/Al2O3,SiO2/TiO2等。最典型的研究最多的氣凝膠是單組份的SiO2氣凝膠和炭氣凝膠(有機氣凝膠)。右圖為有機氣凝膠。

氣凝膠(aerogels)干凝膠(xerogels)並非同一概念,國外相關文獻指出,濕凝膠經過超臨界乾燥得到的是氣凝膠,經過常壓乾燥得到的是干凝膠。嚴格講,氣凝膠應是塊狀結構,而干凝膠一般是粉體或者顆粒。

氣凝膠因其半透明的色彩和超輕重量,有時也被稱為「固態煙」或「凍住的煙」。這種新材料看似脆弱不堪,其實非常堅固耐用,不同成份的氣凝膠可以承受不同的溫度,常見的氧化矽氣凝膠可以在絕對零度到650℃的範圍內使用,有些類型的氣凝膠最高能承受1400℃的高溫。氣凝膠的這些特性在太空探測上有多種用途。俄羅斯「和平」號太空站和美國「勇氣號」火星探測器上,都用到了氣凝膠材料。

氣凝膠是金氏世界紀錄里最輕的固體。  

製備方法

不同氣凝膠的製備方法也不相同。但是其製備歷程大同小異,一般是採用溶膠-凝膠法製備濕凝膠(wet gel),濕凝膠經溶劑置換和超臨界工作得到相應的氣凝膠。  

氣凝膠的特點

(1)孔隙率很高,可高達99.8%;科學家們表示,因為它有數百萬小孔和皺摺,所以如果把1立方厘米的氣凝膠拆開,它會填滿一個有足球場那麼大的地方。它的小孔不僅能像一塊綿一樣吸附污染物,還能充當氣穴。研究人員認為,一些形式的由鉑金製成的氣凝膠能用於加速水解及氫的產生。這樣的話,氣凝膠就能用來生產以氫為基礎的燃料。

 (2)奈米級別孔洞(~20nm)和三維奈米骨架顆粒(2~5nm);

 (3) 高比表面積,可高達1000m2/g;

 (4) 低密度,可低至0.003g/cm3。

 (5)氣凝膠獨特的結構決定了其具有極低的熱導率,常溫下可以低至0.013W/(m.K),比空氣的導熱係數還低。

 (6)強度低,脆性大,由於其比表面積和孔隙率很大,密度很低,導致其強度很低。如SiO2氣凝膠楊氏模量不到10MPa,抗拉強度只有16KPa,斷裂韌度只有0.8kPa.m1/21)孔隙率很高,可高達99.8%;科學家們表示,因為它有數百萬小孔和皺摺,所以如果把1立方厘米的氣凝膠拆開,它會填滿一個有足球場那麼大的地方。它的小孔不僅能像一塊綿一樣吸附污染物,還能充當氣穴。研究人員認為,一些形式的由鉑金製成的氣凝膠能用於加速水解及氫的產生。這樣的話,氣凝膠就能用來生產以氫為基礎的燃料。

(2)奈米級別孔洞(~20nm)和三維奈米骨架顆粒(2~5nm);

(3) 高比表面積,可高達1000m2/g;

(4) 低密度,可低至0.003g/cm3

(5)氣凝膠獨特的結構決定了其具有極低的熱導率,常溫下可以低至0.013W/(m.K),比空氣的導熱係數還低。

(6)強度低,脆性大,由於其比表面積和孔隙率很大,密度很低,導致其強度很低。如SiO2氣凝膠楊氏模量不到10MPa,抗拉強度只有16KPa,斷裂韌度只有0.8kPa.m1/2  

氣凝膠應用

1.超級絕熱材料

材料的熱傳導由氣態傳導、固態傳導和熱輻射傳導決定。由於氣凝膠材料具有奈米多孔結構,因此常壓下氣態熱導率λg很小,真空下熱傳導由固態傳導和熱輻射傳導決定。同玻璃態材料相比,奈米多孔材料由於高孔隙限制了稀疏骨架中鏈的局部激發的傳播,使得固態熱導率λs僅為非多孔玻璃態材料熱導率的1/500左右。Nilsson等檢測室溫下氣凝膠熱導率為0.013~0.016W/(m.K),靜態空氣的熱導率為0.024W/(m.K),即使在800℃的高溫下其導熱係數才為0.043W/(m.K),是目前隔熱性能最好的固態材料。

(1)太陽能熱水器

太陽能熱水器及其他集熱裝置的高效保溫成了能否進一步提高太陽能裝置的能源利用率和進一步提高其實用性的關鍵因素。將奈米孔超級絕熱材料應用於熱水器的儲水箱、管道和集熱器,將比現有太陽能熱水器的集熱效率提高1倍以上,而熱損失下降到現有水平的30%以下。

(2)在熱電池上應用

可延長熱電池的工作壽命,防止生成的熱影響熱電池周圍的元器件。

(3)軍事及太空領域

與傳統絕熱材料相比,奈米孔氣凝膠超級絕熱材料可以用更輕的質量、更小的體積達到等效的隔熱效果。這一特點使其在航空、太空應用領域具有舉足輕重的優勢。如果用作航空發動機的隔熱材料,既起到了極好的隔熱作用,又減輕了發動機的重量。作為外太空探險工具和交通工具上的超級絕熱材料也有很好的應用前景。

凝膠在太空中的應用遠不止這些,美國國家宇航局的「星塵」號太空探測器已經帶著它在太空中完成了一項十分重要的使命———收集彗星微粒。  

星塵號上的氣凝膠方陣

科學家認為,彗星微粒中包含著太陽系中最原始、最古老的物質,研究它可以幫助人類更清楚地了解太陽和行星的歷史。2006年,「星塵」號飛船將帶著人類獲得的第一批彗星星塵樣品返回地球。

但收集彗星星塵並不是件容易的事,它的速度相當於步槍子彈的6倍,儘管體積比沙粒還要小,可是當它以如此高速接觸其它物質時,自身的物理和化學組成都有可能發生改變,甚至完全被蒸發。如今科學家有了氣凝膠,這個問題就變得很簡單了。它就像一個極其柔軟的棒球手套,可以輕輕地消減彗星星塵的速度,使它在滑行一段相當於自身長度200倍的距離後慢慢停下來。在進入「氣凝膠手套」後,星塵會留下一段胡蘿卜狀的軌跡,由於氣凝膠幾乎是透明的,科學家可以按照軌跡輕鬆地找到這些微粒。

(4)工業及建築絕熱領域

在工業及民用領域奈米孔超級絕熱材料有著廣泛和極具潛力的應用價值。首先,在電力、石化、化工、冶金、建材行業以及其他工業領域,熱工設備普遍存在。工業節能中,奈米孔超級絕熱材料也起著非常重要的作用,其中有些特殊的部位和環境,由於受重量、體積或空間的限制,急需高效的超級絕熱材料。  

2.在催化劑以及催化載體方面的應用

氣凝膠是一種由超微粒子組成的固體材料,具有小粒徑、高比表面積和低密度等特點,使SiO2氣凝膠催化劑的活性和選擇性遠遠高於常規催化劑,而且它還可以有效減少副反應的發生。Kister製備出SiO2氣凝膠後不久就指出,氣凝膠因其高的孔隙率、比表面積和開放的織態結構,在催化劑和催化載體方面具有潛在的應用價值,但因小的熱導率和低的滲透性影響了氣凝膠在催化反應中的傳熱和傳質,使其應用受到限制。  

3.在其它方面的應用

SiO2氣凝膠具有極高的比表面積和孔隙率,近年來被廣泛應用於Cerenkov探測器中,以探測高能帶電粒子和在太空中捕集隕石微粒的介質材料。SiO2氣凝膠也曾一度被用於電漿體研究中作為慣性限制熔融試驗體目標組分。因其具有低的表觀密度和熱導率,極好的耐高溫性能,氣凝膠作為高效隔熱消音材料很有前途。

由輕原子量元素組成的低密度、微孔分布均勻的SiO2氣凝膠對氖具有良好的吸附性能,因而為慣性約束聚變實驗研製高增益靶提供了一個途徑,這對於利用受控熱核聚變反應來獲得廉價、清潔的能源具有重要意義。  

4.氣凝膠在日常生活中的應用

氣凝膠也正走進我們的日常生活。運動器材公司鄧祿普(Dunlop)已經研製出一系列用氣凝膠加固的壁球和網球球拍,據說這種球拍能釋放更大的力量。今年初,英國諾丁漢66歲的鮑勃.斯托克爾擁有了一套用氣凝膠隔熱的房子,他也因此成為擁有這種房子的第一位英國人。他說:「保溫效果大大改善了。我把自動調溫器調低了5度。這真是一個不可思議的變化。」

登山者也開始從氣凝膠中受益。去年,一位英國登山者安妮.帕曼特爾穿上帶氣凝膠鞋墊的靴子爬上珠穆朗瑪峰,就連睡袋也加有這種材料。她說:「我唯一的問題就是我的腳太熱,這對一名登山者來說是一個大難題。」

不過,它還沒能征服時尚界。Hugo Boss公司推出了一系列用這種材料製成的冬季夾克,但在消費者紛紛抱怨這種衣服太熱之後不得不下架。

在環境保護及化學工業方面,奈米結構的氣凝膠還可作為新型氣體過濾 ,與其它材料不同的是該材料孔洞大小分布均勻,氣孔率高,是一種高效氣體過濾材料。由於該材料特別大的比表而積.氣凝膠在作為新型催化劑或催化劑的載體方而亦有廣闊的應用前景。  

5.在電化學方面的應用

在儲能器件方而,有機氣凝膠經過燒結工藝處理後將得到碳氣凝膠 這種導電的多孔材料是繼纖維狀活性碳以後發展起來的一種新型碳素材料,它具有很大的比表面積(600—1000 m2/g)和高電導率(10~25 s/cm).而目.密度變化範圍廣(0.05~1.0 g/cm3).如在其微孔洞內充人適當的電解液,可以製成新型可充電電池,它具有儲電容量大、內阻小、重量輕、充放電能力強、可多次重複使用等優異特性,初步實驗結果表明:碳氣凝膠的充電容量達3×104/kg2,功率密度為7 kw/kg,反覆充放電性能良好。  

6.儲氫材料

氫能具有很高的熱值,燃燒釋能後的產物是水,對環境無污染,此外,氫能為可再生能源,不會枯竭,

因而被譽為21世紀的綠色新能源。美國Lawrence Livermore國家實驗室和伊利諾斯大學研究表明:炭氣凝膠具有高比表面積、低密度、連續的網路結構且孔洞尺寸很小又與外界相通,具有優良的吸、放氫性能。美國能源部於2005年專門設立了機構,研究摻雜金屬的炭氣凝膠貯氫,並給予財政資助。  

7.氣體或者液體吸附

氣凝膠還可以用作吸附材料,不如吸附CO2氣體,吸附一些化學有毒蒸汽,吸附炸藥廢水等。  

研究機構

目前國際上關於氣凝膠材料的研究工作主要集中在德國的維爾茨堡大學、BASF公司、美國的勞倫茲.利物莫爾國家實驗室、桑迪亞國家實驗室,法國的蒙彼利埃材料研究中心,日本高能物理國家實驗室,美國aspen公司,美國宇航局等。國內主要集中在同濟大學波爾固體物理實驗室、國防科技大學、紹興納諾高科、英德埃力生、山東科技大學等。  

國內外工業化生產情況

作為新興奈米材料,目前世界能工業生產的企業不多,國際上較知名的有美國的ASPEN和CABOT,國內進行氣凝膠商業化的企業有浙江紹興的納諾高科股份有限公司,英德市的埃力生亞太電子有限公司。  

凝膠護膚品

天然凝膠是存在於植物凝膠(海和陸地的植物)、動物凝膠、高山凝膠(礦物)等大自然中,是自然界存在的粘質,但又具有它們各自的特性。從這些天然物質中提煉出來的全新凝膠成分,多種凝膠成分相互組合,讓肌膚體驗一種從未有過的感覺。

從纖維素、植物種子和礦物天然物質中提煉出來的全新凝膠成分,將其中的粘質體通過生化工程,合成肌膚中真正需要的細胞間脂質

深海凝膠: 含豐富的維他命,微量礦物元素,有效預防老化。

植物凝膠: 促進皮膚的再生,具有消炎,鎮靜的功能。

高山凝膠: 具有殺菌、防腐的功能和良好的吸附能力。

動物凝膠: 活化細胞、增加肌膚的彈性及保濕能力。 

針對皮膚乾燥問題,以及揮之不去的肌膚煩惱,迄今為止的化妝品主要是補充水分和油分,並沒有滿足肌膚真正需要,人的皮膚細胞中與自然界凝膠有著同樣的保濕功能,這就是凝膠重要的品質因素。天然凝膠具有良好的透氣性來實現滋潤與鎖水,讓肌膚保持持久的親膚性。

目前,凝膠護膚品以其天然、安全、無油、無添加而風靡日本美容界,如誠美的「細胞源」原裝進口系列產品。在中國,凝膠護膚品處於剛剛起步階段,比較知名的如jeru肌如凝膠護膚品。但可以預見,在不遠的將來,凝膠護膚品將受到越來越多中國愛美人士的青睞。

參看

關於「凝膠」的留言: Feed-icon.png 訂閱討論RSS

目前暫無留言

添加留言
個人工具
名字空間
動作
導航
功能菜單
工具箱