內切酶
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內切酶（incision enzyme），即限制性核酸內切酶。亦稱限制性核酸酶。 這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同於一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序
——識別順序。長期以來，難以深入研究的DNA大分子,藉此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發現,為基因結構、DNA鹼基順序分析和基因工程的研究開闢了途徑。為此，W.阿爾伯，H.史密斯和D.內森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾生理學或醫學獎。
一種能催化多核苷酸的鏈斷裂的酶，只對脫氧核糖核酸內一定鹼基序列中某一定位置發生作用，把這位置的鏈切開。通過內切酶可以把某一個遺傳基因切下來，若再連在別的細胞的遺傳基因上，便可使這細胞具有新的遺傳特性。內切酶的發現和採用，使基因工程成為可能。
內切酶的分類
內切酶主要分成三大類。第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，無法用於分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由於這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，並能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分布是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有（3×109/4×103）約106個切點。
第二類內切酶的識別順序是一個迴文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個向「讀」都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：
↓ ｜
5』……GAA ｜ TTC……3』
3』……CTT ｜ AAG……5』
｜ ↑
垂直虛線表示中心對稱軸，從兩側「讀」核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是迴文順序（palindrome）。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割後生成5』……G和AATTC……3』、3』……CTTAA和G……5』二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，可通過形成氫鍵而「粘合」。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如HaeⅢ的識別位置是：
↓
5』……GG↓CC……3』
3』……CC↓GG……』
↑
在箭頭所指處切割，產生的兩個DNA片段是：
5』……GG CC……3』
和
3』……CC GG……5』
有時候兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在於當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5』……GCGG……3』，如果其中有5』-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。
第三類內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的迴文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內切酶切割後產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對於克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。
內切酶用於克隆PCR
克隆PCR產物的方法之一，是在PCR產物兩端設計一定的限制酶切位點，經酶切後克隆至用相同酶切的載體中。但實驗證明，大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護鹼基，才能使所定的限制酶對其識別位點進行有效切斷。
酶切位點（內切酶的識別序列）要加在引子的5'端，為保證PCR產物能被限制性內切酶的識別且有效的酶切，一般在引子的5'端酶切位點側邊加上保護鹼基。
具體為：5'-保護鹼基＋酶切位點＋引子序列-3'
詳細可參見，如下圖：
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