內切酶

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內切酶(incision enzyme),即限制性核酸內切酶。亦稱限制性核酸酶。 這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同於一般的脫氧核糖核酸酶(DNase),它們的切點大多很嚴格,要求專一的核苷酸順序

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——識別順序。長期以來,難以深入研究的DNA大分子,藉此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發現,為基因結構、DNA鹼基順序分析和基因工程的研究開闢了途徑。為此,W.阿爾伯,H.史密斯和D.內森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾生理學或醫學獎。

一種能催化多核苷酸的鏈斷裂的酶,只對脫氧核糖核酸內一定鹼基序列中某一定位置發生作用,把這位置的鏈切開。通過內切酶可以把某一個遺傳基因切下來,若再連在別的細胞的遺傳基因上,便可使這細胞具有新的遺傳特性。內切酶的發現和採用,使基因工程成為可能。  

內切酶的分類

內切酶主要分成三大類。第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序,並在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈,但是切割的核苷酸順序沒有專一性,是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處,無法用於分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。

第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序,並在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由於這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段,並能構建來自不同基因組的DNA片段,形成雜合DNA分子。因此,這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸,少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分布是隨機的,則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46(4096)個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸,識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有(3×109/2.5×102)約107個切點,也就是可被這種酶切成107片段,識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有(3×109/4×103)約106個切點。

第二類內切酶的識別順序是一個迴文對稱順序,即有一個中心對稱軸,從這個軸朝二個向「讀」都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割,結果形成兩條單鏈末端,這種末端的核苷酸順序是互補的,可形成氫鍵,所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為:

↓ |

5』……GAA | TTC……3』

3』……CTT | AAG……5』

| ↑

垂直虛線表示中心對稱軸,從兩側「讀」核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG,這就是迴文順序(palindrome)。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置,切割後生成5』……G和AATTC……3』、3』……CTTAA和G……5』二個DNA片段,各有一個單鏈末端,二條單鏈是互補的,可通過形成氫鍵而「粘合」。另一種是在同一位置上切割雙鏈,產生平頭末端。例如HaeⅢ的識別位置是:

5』……GG↓CC……3』

3』……CC↓GG……』

在箭頭所指處切割,產生的兩個DNA片段是:

5』……GG CC……3』

3』……CC GG……5』

有時候兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同,差別只在於當識別順序中有甲基化的核苷酸時,一種限制性內切酶可以切割,另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5』……GCGG……3』,如果其中有5』-甲基胞嘧啶,則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶(isoschizomer)。

第三類內切酶也有專一的識別順序,但不是對稱的迴文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此,這種限制性內切酶切割後產生的一定長度DNA片段,具有各種單鏈末端。這對於克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。  

內切酶用於克隆PCR

克隆PCR產物的方法之一,是在PCR產物兩端設計一定的限制酶切位點,經酶切後克隆至用相同酶切的載體中。但實驗證明,大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護鹼基,才能使所定的限制酶對其識別位點進行有效切斷。

酶切位點(內切酶的識別序列)要加在引子的5'端,為保證PCR產物能被限制性內切酶的識別且有效的酶切,一般在引子的5'端酶切位點側邊加上保護鹼基。

具體為:5'-保護鹼基+酶切位點+引子序列-3'

詳細可參見,如下圖:

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