基因診斷與性病/巨細胞病毒感染症

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病目錄

巨細胞病毒感染感染人類巨細胞病毒(human cytomlegalovirus,HCMV)的一種全身感染症候群。因被感染細胞變大,核內和胞漿內出現包涵體,故本病又稱巨細胞包涵體病(Cytomegalic inclusion disease,CID)。巨細胞病毒感染症可分兩種類型,一種是唾液腺病毒症,是無症状限局性感染,嬰幼兒較常見;另一種是全身感染,主要侵犯嬰兒,比較少見。但由於性俗的改變,成人由性行為感染此類病毒在西方國家較為常見,故已歸為性傳播性疾病

目錄

第一節 病原學

CMV屬於皰疹病毒群,是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒,其形最大由162個殼粒(capsomer),正20面體構成。有典型的皰疹病毒結構。CMV只能在人纖維母細胞培養中增殖,而不能在其他動物細胞中生長,增殖非常緩慢,初次分離需一個多月才能出現特殊的細胞;細胞變園,膨脹,細胞及核巨大化,核周圍出現一輪「暈」的大型嗜酸性包涵體。

CMV在20%乙醚中最多存活2小時。pH<5時,或置於56℃30分鐘,或紫外線照射5分鐘可被充分滅活。CMV的感染性對凍融或存於-20℃或-50℃均不穩定,10%的家用漂白粉可使其感染性明顯降低。

第二節 CMV基因組結構

CMVDNA為線性雙鏈分子,約235-240kb,長度為56-76nm,其分子量為150-160×103KDa,不同種屬的CMv DNA分子量基本相同。各毒株DNA有80%同源序列,通過限制性酶譜可區分不同毒株。CMV與其他皰疹病毒一樣,具有1個長的單一序列(UL)及1個短的單一序列(US)。UL和US的相連處及兩端均為DNA重複序列。UL約115×103KDa,約佔16%。UL兩端的兩個反向重複序列約佔90%;US兩端的兩個反向重複序列約佔2%。由於UL及US可以兩種方向存在,則CMv DNA具有4種分子異構型,但除人類巨細胞病毒(HCMV)及鼠CMV外,其它動物CMV無異構型存在。CMvDNA只有一個單向性的IE啟動子複合體,其可指導多個基因的表達。CMV基因組至少能編碼胺基酸殘基數100以上的多肽200餘種,包括原始基因產物,中間產物及終未產物。

巨細胞病毒基因組的重複序列對其複製、基因表達方向以及與細胞相互作用的方式可能有重要意義。用核酸外切酶處理雙鏈巨細胞病毒DNA可形成粘性末端而接連成環狀,這一特點可能與該病毒的轉化作用和潛在的致癌性有關。

第三節 感染途徑

CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關係。如因器官移植而接受免疫抑制劑治療者,常因所供器官和輸入血液中有潛伏病毒,或免疫抑制使潛伏的病毒活化而發病,愛滋病患者的CMV感染發病率高。

傳染源是病人及其急性帶毒者,病毒可由乳汁、唾液及尿排出,可持續數周到幾年,人類易於感染,傳播途徑多種多樣。屬於性傳播性疾病。多從精液,宮頸分泌物,淚液及糞便(口腔性慾,吻肛)感染所致。(見表1)

同源性CMV感染是輸血和器官移植的一種嚴重危害,多次輸血或一次大量輸血使原發和再發感染的危險性增高,輸入含白細胞血液的危險性更高,器官或骨髓移植術後CMV感染率也高。

CMV感染途徑(環)表 表1

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第四節 發病機理

初次感染後,CMV將在宿主細胞中無限期存在成潛伏狀態。可能累及多種組織器官,屍檢提示肺、肝、胰、唾液腺、中樞神經系統及腸也可能是病毒潛伏場所。先天性感染的嚴重程度,與缺乏產生沉澱抗體的能力和T細胞對CMV的應答有關。兒童和成年人感染CMV後,在外周血中出現具有抑制細胞表型的活化T淋巴細胞,如果宿主的T細胞功能受損,潛伏的病毒就可能復活並引起多種症候群。組織移植後發生的慢性刺激,為CMV活化,誘發疾病提供了條件。某些針對T細胞的強烈免疫抑制劑如抗胸腺細胞球蛋白,與臨床CMV症候群高發率有關。此外,CMV在功能上可作為輔助因子,使潛伏感染的HIV活化。

第五節 免疫學

CMV感染可引起機體的免疫功能降低,特別是細胞免疫功能下降。CMV感染對胸腺發育及脾細胞單核吞噬細胞、NK細胞及CTL細胞的功能有著顯著的影響。

一、對胸腺、脾臟的影響

實驗室急性CMV感染的新生豚鼠,胸腺發育受抑,T細胞數減少,成年鼠感染CMV後,88%胸腺可檢出CMV。

CMV感染致脾功能受影響,脾臟淋巴細胞對conA刺激的增殖下降,脾細胞產生的IL-2顯著降低。

二、對免疫細胞的影響

CMV感染引起的免疫抑制與病毒在細胞內的複製有關。CMV可以在單核吞噬細胞、T細胞、B細胞及一些尚未確定的單核細胞中複製,其中單核吞噬細胞最易感染CMV,淋巴細胞在免疫反應中具有重要的調節功能和效應功能。CMV感染後,可引起淋巴細胞的多種免疫功能受損。

CMV感染多表現為急性單核細胞增多症。外周血淋巴細胞對有絲分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反應減弱,誘導干擾素水平下降,CD4/CD8比值從1.7±0.7下降為0.2+0.2,T細胞活性降低.這種變化有的可持續相當長時間,病後10個月,大多數患者T細胞亞群比例仍未完全恢復正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大單核細胞和CD8細胞的功能異常所致。單核吞噬細胞在抗CMV免疫中起著樞紐作用,不但可以直接吞噬、殺傷病毒,更重要的是可以處理、提呈抗原,分泌細胞因子,調控和擴大免疫反應。當CMV感染後,單核吞噬細胞功能受到影響,CMV感染巨噬細胞引起其吞噬功能降低,細胞內氧自由基產生減少,FC受體補體受體的表達發生改變,且其抗原提呈功能降低,產生IL-1降低,對IL-1及IL-2的反應亦降低。Moses等用胸腺細胞增殖試驗檢測,IL-1活性降低,IL-1產生降低可引起TH/TS細胞比例失衡。

NK細胞有拮抗CMV擴散的作用。NK細胞積極參與了抗CMV感染的全過程,但存在高的NK活力不一定是保護性應答,而是活動性感染的證明。NK細胞雖不能阻止原發性CMV感染的出現,但一旦存在感染後,NK細胞能在CMV感染早期出現,有限制擴散、使感染局限的作用。NK細胞、CTL細胞是抗CMV的重要效應細胞。在CMV複製早期,感染性病毒體產生前,它們能裂解感染細胞,使病毒在細胞間擴散流產。在小鼠模型中,病毒作用了3-5天時,抗病毒效應由NK細胞介導,NK細胞活性可由IFN增強。6-21天,脾、外周血存在CTL細胞的殺傷活性。NK細胞、CTL細胞活性的高低決定了機體對CMV感染的敏感性及感染恢復的難易性。但CMV感染時,NK細胞及CTL細胞活性亦受到嚴重影響。此外,特異性細胞免疫有阻止CMV感染再發作用。有人檢測了20個發生CMV感染腎移植受者T細胞應答,發現有14個有CMV細胞毒應答,而6個不出現細胞毒應答者有嚴重的臨床後果。因此,特異性T細胞存在,有阻止CMV感染再發的作用。

三、抗體有降低CMV感染的毒力作用

機體受CMV的感染後,可出現多種抗體。乳汁、宮頸分泌物、唾液中儘管有特異性抗體出現,包括中和抗體。但仍能檢出CMV,說明抗體並不能阻止病毒擴散。胎兒從母體被動獲得的抗體不能阻斷經宮內、產道或乳汁傳播的感染。研究證明,致死性CMV攻擊前,在小鼠腹腔或靜脈注入0.2ml高效價抗CMV球蛋白,可完全保護動物免於死亡。1個月後再用CMV等二次攻擊,動物仍全部存活,表明抗體有降低CMV的毒力作用。

第六節 臨床表現

CMV感染的自然史很複雜,在原發性感染以後排毒,往往持續數周、數月甚至數年,然後感染轉為潛伏。常有複發感染伴重新排毒。甚至在原發感染後很多年,潛伏病毒再激活,也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的臨床表現與個體免疫功能和年齡有關。從表2所示,不論從垂直感染、平行傳播或醫源性感染所出現的症状體征都是多種多樣的。

表2 CMV感染症臨床經過與病型(Baerlocher等)

1.新生兒感染(先天性)
a.重症型:黃疸貧血肝脾腫大血小板減少性紫癜,侵犯中樞神經,肺炎心肌炎
b.輕症型:假死心臟肥大,高膽紅素血症
2.出生後無症状期,乳兒期再感染CMV(先天性/後天性?)
a.全身型
b.呼吸系型(百日咳樣)c.肝脾腫大
d.胃腸型
e.腎型?
3.後天型
a.流感
b.單核細胞增多症
c.呼吸系型
d.胃腸型
e.肝炎
f.因特殊醫療防禦能力低下
g.無症型?
4.1、2、3項的後果即精神、運動發育遲緩

關於後天性CMV感染症,在臨床中常見於輸血後的單核細胞增多症,由於免疫功能缺陷而發生血管網膜炎、肺炎以及消化道感染。並且大多數患者合併格-巴氏症候群。

第七節 診斷

單靠臨床表現不能診斷CMV感染,從臨床標本中分離出病毒,同時抗體呈出4倍以上增加或持續抗體滴度升高,將有助於診斷。

一、病毒分離

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細胞,接種到人的成纖維細胞內繁殖和分離,細胞病變效應(CPE)在1天或數周后出現,經固定和HE染色後可觀察到巨細胞,核內有內包涵體,核周暈圈及嗜酸性胞漿內包涵體,很象「貓頭鷹眼」(owl′s eye)亦可用單克隆或多株抗體的熒光染色等方法檢查。

二、血清抗體檢測

最常用的有補體結合試驗(CF)、間接免疫熒光試驗(IIF)、免疫酶試驗(EIA)、間接血凝試驗(IHA)和放射免疫試驗(RIA)等檢測CMV-IgG和IgM抗體。當單份血清標本已確定既往有CMV感染時,應當立即留血清標本,以及間隔2周、4周、8周再留血清標本,結合病毒分離可作原發感染診斷。

三、DNA探針

已廣泛應用於檢測CMV,其中以32P標記的探針敏感性最高,對某些標本來說,雜交方法可能比病毒分離更敏感。

四、聚合酶鏈式反應(PCR)

(一)標本的採集及處理

採集的標本包括患者的血液、尿,以及腺體組織等。由全血製備的血沉棕黃層(buffy coats)可保存於-80℃;尿液標本可保存於液氮中。凍存標本應避免反覆凍融。

尿液標本經2500r/min離心10min,以除去細胞碎片,收集上清液。由於尿液中含有PCR抑制劑,因此需用聚乙二醇(PEG6000)進行預處理:50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min離心30min收集沉澱。再於6400r/min離心3min;儘可能吸去上清,將沉澱懸浮於蒸餾水中。該懸液可直接用於PCR擴增;擴增時應於100℃加熱10min,迅速置冰浴中冷卻。

(二)模板DNA的製備

1.由血液標本製備模板DNA

方法A:向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L;取10μl 此血清於70℃處理45s後即可直接進行PCR擴增。

方法B:由血沉棕黃層(BCP)製備:① 用PBS洗滌BCP兩次,收取沉澱。②加入500μl 6mol/L鹽酸胍,勻漿。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml),混合均勻,60℃反應1h。④加入1130μl 的乙醇,-20℃沉澱1~2h。⑤ 離心收集DNA沉澱。⑥用70%乙醇洗兩次,最後將沉澱懸浮於少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/l EDTA中。置4℃備用。

2.由冰凍組織標本製備模板DNA:①用恆冷切片機切取一塊~10μm冰凍組織塊,置於1.5ml塑料管中。②加入10%用緩衝液配製的福馬林。③ 10min後離心1~2min輕輕傾去上清液,沉澱用乙醇洗2次。④於室溫乾燥10~60min。⑤ 加入抽提緩衝液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使剛好浸沒沉澱物(約50~100μl);將沉澱搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經脫蠟和乾燥後也可按此處理。⑥37℃放置過液。⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。⑧離心收集上清,取1~10μl 即可進行PCR擴增。

3.由尿液標本製備模板DNA:①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍,7μl 2mol/LNaCl和20μl 玻璃粉懸液(DNa PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。② 室溫放置10min後,6400r/min離心2min,收集沉澱。③沉澱用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min離心1min。④同樣洗滌沉澱2次,收集沉澱。⑤ 加入50μl 蒸餾水,於55℃作用15min。⑥15000r/min離心2min,收集上清(含HCMV DNA),進行PCR擴增,將此懸液於100℃加熱10min,並迅速於冰浴中冷卻。

(三)引子及探針

引子及探針的設計是根據已發表的CMV的直接早期蛋白基因的啟動子區和開始的4個外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引子和探針列在表3中。

(四)PCR擴增步驟

1.10×反應緩衝液:100mmol/LTris-HCl、pH8.4,500mmol/l KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml明膠

Taq DNA 聚合酶:5U/μl 。

10×dNTP:4種dNTP各2.0mmol/L。

引子:100pmol/L。

2.常規PCR擴增

10×反應混合物(50μl)反應緩衝液 5μl

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引子 各0.5μl

蒸餾水 3.8μl

加1~2滴礦物油。

將反應混合物於94℃加熱5min;然後於95℃ 30s,55℃40s,72℃ 60s,擴增35~40循環。

表3 CMV PCR擴增所用的引子及探針

引子及探針 序列(5′→3′) 位置 片段大小
IE1 CCACCCGTGGTGCCAGCTCC 早期基因 159(bp)
IE2 CCCGCTCCTCCTGAGCACCC
IE3(探針) CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC
LA1 CCGCAACCTGGTGCCCATGG 晚期gp64 139
LA2 CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG
LA3(探針) TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG
IE1a AGATCGCCTGGAGACGCCAT 早期外顯子1 139
IE1b GGAATCCGCGTTCCAATGCA
IE2a ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG 早期外顯子2 72
IE2b CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
IE3a GTGACCAAGGCCACGACGTT 早期外顯子3 167
IE3b TCTGCCAGGACATCTTTCTC
IE4a ACAGATTAAGGTTCGAGTGC 早期外顯子4 179
IE4b CAATACACTTCATCTCCTCG
IE4c TTACCAAGAACTCAGCCTTC 早期外顯子4 158
IE4d GTGCGTGAGCACCTTGTCTC
IE4e TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA 早期外顯子4 426
IE4f ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG
Pp1a TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT Pp71基因 316
Pp1b ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC Pp71

3.套式(nested)PCR擴增:①反應混合物的組成同(2),僅引子為IE2a和IE4b(包括了整個外顯子3,共721b),各100pmol。於94℃60s,52℃150s,72℃ 480s,擴增20循環。② 取2μl 上述擴增產物,各加100pmol的引子IE3a和IE3b補加其他試劑。然後,於94℃60s,52℃150s,72℃180s,擴增20循環。

(五)產物鑒定

擴增產物的分析可採用固相(濾膜)雜交和液相雜交試驗。

1. 固相雜交:

① 預雜交液為3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲醯胺.含有擴增產物的濾膜於42℃預雜交30~60min。②加入標記探針(10cpm/μg,2ng/ml),雜交30~60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別於室溫洗滌濾膜3次,5min/次;於60℃洗一次,10min/次;再於室溫洗一次以上,5min/次。④自顯影。

2. 液相雜交及電泳分析:

① 取1/10體積的擴增產物與0.5~1.0pmol末端記的探針混合。②加入最終濃度為150mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液,使總體積為20μl 。③ 95℃ 10min,然後於56℃ 60min。④ 離心10s加入樣品緩衝液,於8%聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳。⑤電泳畢,用溴化乙錠染色,然後對X線片曝光,自顯影。

HCMV DNA分子很大,其鹼基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內切酶片段長度具多形性,但是對其基因組的離散性還不清楚。用單一引子對進行PCR擴增,可鑒定90%的HCMV野型分離株;而採用針對不同HCMV序列的兩套以上的引子對,則可檢測幾乎所有的病毒株。因此,可根據情況使用兩對或兩對以上的位於基因組不同區域的引子進行PCR檢測。

在HCMV模板DNA製備過程中,有時會產生一些小片段DNA,在PCR反應時常導致一定水平的本底產物,從而影響對結果的判定。在這種情況下可採用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的擴增分為兩步:首先利用一對引子,擴增包括靶DNA在內的長片段DNA;然後取少量的擴增產物,利用只針對靶DNA的引子再進行第二次擴增。通過控制每步中的擴增循環數,即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產生假陰性結果。

PCR檢測HCMV標本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養上清可檢測到相當於幾十個病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進行Southern雜交分析擴增產物,可從尿液標本中檢測到1pgHCMv DNA序列的水平;利用該系統,在4×104個細胞中只有一個病毒基因組即可檢測出,較斑點印跡雜交提高2×103倍。

PCR技術對HCMV感染的檢測具有臨床應用價值,因為體液中病毒DNA先於病毒感染的臨床症状或血清學證據的出現,可作為HCMV感染的早期指標。由於HCMV可通過胎盤內感染、產道感染等途徑傳播,而且受感染的新生兒死亡率較高,因此利用PCR進行早期診斷及採取及時的治療措施,對優生優育也有重要意義。利用這種方法,還可鑒定器官或組織移植手術中供體是否為HCMV與許多嚴重病症的關係。再者,PCR檢測指標穩定,還可進行半定量分析,因此可作為評價各種抗病毒藥物療效的手段。

第八節 治療

巨細胞病毒感染的治療,可應用各種抗病毒製劑如GCV、抗巨細胞病毒的免疫球蛋白製劑、干擾素及轉移因子等。但這些藥物並不能解決根本問題,往往停藥後病毒又潛伏地回升,鑒於此種病毒可能作為愛滋病的病因之一,各國學者均在致力於控制其感染的研究。最近,美國學者研製出兩種活疫苗,初試後頗見效。一種是由AD169菌株研製成的;另一種是從TOWn菌株製成的,經非腸道給藥後,已明顯表現出有抗巨細胞病毒的效能,CMV抗體升高,導致免疫功能增強。

參看

32 生殖器皰疹 | 軟下疳 32
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