用人工定向變異方法，或從自然界篩選出毒力減弱或基本無毒的活微生物製成活疫苗或減毒活疫苗。常用活疫苗有卡介苗（BCG，結核病）、麻疹疫苗、脊髓灰質炎疫苗（小兒麻痹症）等。接種後在體內有生長繁殖能力，接近於自然感染，可激發機體對病原的持久免疫力。活疫苗用量較小，免疫持續時間較長。活疫苗的免疫效果優於死疫苗。
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