單株抗體

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抗體是由B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的。每一個B淋巴細胞在成熟的過程中通過隨機重排只產生識別一個抗原的抗原受體基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系,重排後具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時,抗原分子上的許多抗原決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞(漿細胞)和記憶B細胞,大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個製造一種專一抗體的漿細胞進行培養,就可得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群,即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體,稱為單株抗體。  

目錄

單株抗體技術的基本原理

要製備單株抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞,但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖,應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一,得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性,它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性,用這種來源於單個融合細胞培養增殖的細胞群,可製備抗一種抗原決定簇的特異單株抗體。

單株抗體是僅由一種類型的細胞製造出來的抗體,對應於多株抗體/多株抗體——由多種類型的細胞製造出來的一種抗體。

單株抗體技術過程簡圖

單株抗體由可以製造這種抗體的免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合後的細胞產生的,這種融合細胞即具有瘤細胞不斷分裂的能力,又具有免疫細胞能產生抗體的能力。融合後的雜交細胞(雜種瘤)可以產生大量相同的抗體。當其應用於醫療中時,在識別抗原中的顯示的微小變化(如果有的話)有助於減小副作用

1975年,德國科學家喬治.克勒和阿根廷科學家凱撤.米爾斯坦,把產生抗體的B淋巴細胞與多發性骨髓瘤細胞進行融合,形成雜交瘤細胞。這種細胞兼有兩個親代細胞的特徵,既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力,又有B淋巴細胞產生抗體的功能。因此,這種雜交瘤細胞就能在細胞培養中產生大量單一類型的高純度抗體。這種抗體叫「單株抗體」。

單抗隆抗體的製備

雜交瘤細胞的大量繁殖

克隆化的細胞可以在體外進行大量培養,收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單株抗體有限,其不能超過特定的細胞濃度,且每天要換培養液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠(無胸腺的裸鼠),雜交瘤細胞就開始無限地繁殖,直至宿主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單株抗體,這種抗體的效價往往高於培養細胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制劑,如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等,可以加速和促進腫瘤的生長。

1.材料

  1. 高壓滅菌的降植烷。
  2. Balb/c鼠:5~8周齡。
  3. 雜交瘤細胞:取對數生長期的細胞。
  4. RPMI—1640培養液
  5. 新生牛血清

2.操作方法

  1. 於小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射後1~9周內種植細胞。
  2. 收取對數生長期的雜交瘤細胞,用5%FCS—1640液洗滌一次,1 000r/min離心10min。
  3. 取樣,用台盼蘭染色,計活細胞數,重新用5%FCS—1640液配成1.0×107細胞/ml的懸液。
  4. 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細胞,每隻腹腔注射1ml(含1.0×107個細胞/ml)。
  5. 接種後10天左右時間腫瘤體積最大,此時可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下動脈或心臟采血後分離。

單株抗體的提純

1.材料

  1. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩衝液,20 mMol/L NaCl
  2. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩衝液,40mMol/L NaCl
  3. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩衝液,80 mMol/L NaCl
  4. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩衝液
  5. 飽和硫酸銨液
  6. DEAE—纖維素柱

2.操作方法

  1. 小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍後,於1.00×105轉離心30min,去沉澱。
  2. 在4℃於上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液,邊加邊攪拌,使溶液最終為50%硫酸銨濃度。
  3. 此溶液置冰中30min~60min,然後5 000r/min離心10min,去上清。
  4. 將沉澱溶於Tris-HCl緩衝液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混濁)。
  5. 裝入透析袋於Tris-HCl緩衝液(20 mMol/L NaCl)中透析除鹽。
  6. 離心去沉澱。
  7. 溶液稀釋(1:100或更高倍稀釋)後,於280nm測蛋白含量,估計蛋白質含量. 1A 280unit=0.8mg蛋白質。一般每ml腹水中,含有總蛋白約25mg~36mg。
  8. 過DEAE—纖維素柱:纖維素柱高40cm,以20mMol/L NaCl Tris緩衝液平衡。透析樣品以Tris緩衝液等量稀釋。

樣品進入柱床速度為1ml~2ml/min,以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG於40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫,也有極少例外的單株抗體於120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。

測OD280nm收集蛋白峰,單克隆IgG保存備用。

雜交瘤產生各種免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪種為主,則決定於抗原的免疫程序。免疫一次,且3天後就取脾,多為產生IgM的B淋巴細胞。免疫多次的多為IgG。

單株抗體的鑒定

  1. 雜交瘤細胞染色體的檢查 採用秋水仙素裂解法進行。
  2. 單株抗體的類型、亞型的測定:購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標準抗血清,採用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
  3. 單抗的特異性鑒定 可以採用各種方法,如免疫熒光法ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等,同時還需做免疫阻斷試驗等。
  4. 單抗的效價測定 可採用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。採用凝集反應,腹水效價可達5×104。而採用ELISA檢查,腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。
  5. 必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。  

醫學用途

把單株抗體與抗癌藥物毒素結合起來,就成為威力強大的抗體「生物飛彈」。把這種抗體「飛彈」注射到癌症患者的血液中,它就會發揮飛彈樣的作用,在患者體內追蹤並附著於癌細胞上,然後與抗體結合的抗癌藥物或毒素殺傷和破壞癌細胞,而且很少損傷正常組織細胞。這種抗體「飛彈」具有高度選擇性,對癌細胞命中率高,殺傷力強的優點,沒有一般化學藥物那樣不分好壞細胞,格殺勿論的缺點。美國約翰.霍普金斯醫院應用抗體「飛彈」治療晚期肝癌病人,收到驚人效果。肝臟顯著縮小,生存期延長,而且沒有副作用。單株抗體技術的發明,是免疫學中的一次革命,打破了過去只能在身體內產生抗體的方法,而成功地在體外用細胞培養的方法產生抗體,同時繁殖快,可以產生在體內達不到的高滴度和高專一性的水平。它來自於每一個細胞,所以非常純淨。

單株抗體在疾病的診斷和治療預防方面,與常規的抗體相比,特異性強,靈敏度高,優越性非常明顯,可利用此特性製成「生物飛彈」用來運送藥物至病害部位,主要是癌細胞。在生物飛彈中,能識別抗原的單株抗體充當瞄準鏡,將抗癌藥物(彈頭)傳送到癌細胞,從而使抗癌藥物發揮藥效。

參看

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