沙門氏菌
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沙門氏菌（Salmonella）沙門氏菌病的病原體。屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發現的近一千種(或菌株)。按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，但有時也可污染人類的食物而引起食物中毒。
目錄 |
沙門氏菌基本介紹
沙門氏菌病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細菌科，包括那些引起食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。它們除可感染人外，還可感染很多動物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染後可呈無症状帶菌狀態，也可表現為有臨床症状的致死疾，
它可能加重病態或死亡率，或者降低動物的繁殖生產力。
蛋、家禽和肉類產品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決於沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。根據國際慣例，要求對易受沙門氏菌污染的食品進行分類管理，以使大多數食物不含沙門氏菌，從而有效預防沙門氏菌病。為此，人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程中，作出了不懈的努力，現將有關進展報告如下，並介紹兩種快速檢測沙門氏菌的試劑盒。
沙門氏菌抗原構造與分類
o抗原
為脂多糖，性質穩定。能耐100℃達數小時，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定o型原特異性的是脂多糖中的多糖側鏈部分，以1、2、3等阿拉伯數字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個；豬霍亂桿菌有6、7二個。其中有些o抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同o抗原沙門氏菌歸為一組，這樣可將沙門桿氏菌屬分為a～z、o51～o63、o65～o67共有42組。我國已發現26個菌組、161個血清型。使人類致病的沙門氏桿菌大多屬於a～e組。o抗原刺激機體主要產生lgm抗體。
h抗原
為蛋白質，對熱不穩定，60℃經15分鐘或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細菌經甲醇液固定後，其o抗原全部被h抗原遮蓋，而不能與相應抗o抗體反應。h抗原的特異性取決於多肽鏈上胺基酸的排列順序和空間構型。
沙門氏桿菌的h抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的細菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據h抗原不同，可進一步分種或型。h抗原刺激機體主要產生lgg抗體。
vi抗原
因與毒力有關而命名為vi抗原。由聚-n-乙醯-d-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩定，經60℃加熱、石碳酸處理或人工傳代培養易破壞或丟失。新從患者標本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。vi抗原存在於細菌表面，可阻止o抗原與其相應抗體的反應。vi抗原的抗原性弱。當體內菌存在時可產生一定量抗體；細菌被清除後，抗體也隨之消失。故測定vi抗體有助於對傷寒帶菌者的檢出。
沙門氏菌在感染細胞時採取嚴格的「三步走」戰略。首先，在自己的表面形成一個針狀突起，以此建立和目標細胞之間的接觸，然後，一些專門的蛋白質會通過這個突起抵達目標細胞，破壞目標細胞的細胞膜，打出一個「洞」，最後，沙門氏菌細胞通過這個「洞口」向目標細胞釋放真正具有毒性的蛋白質。
傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌
兩種生物如果在生物分類上被歸入一個種，想必是非常親近的了。傷寒沙門氏菌Salmonella Typhi和鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium這兩個名字，看起來也夠像的。不過，它們的行為大不相同，基因序列也沒有那麼像。
傷寒沙門氏菌只感染人類，損害肝、脾和骨髓，每年導致1600萬人生病，60萬人死掉，由於越來越多菌株具有抗藥性，情況可能變得更糟。鼠傷寒沙門氏菌對生活環境不那麼挑剔，幾乎可感染一切地上走的或爬的活物，在人類身上造成的症状一般是食物中毒（愛吃生雞蛋的人小心），聽起來好像沒有傷寒那麼可怕，但一些科學家認為它的威脅更大，由此造成的食物中毒事件實際發生數目比報告數目可能多出30倍，每年有上億人感染，死亡人數比傷寒沙門氏菌多出一倍，主要是嬰幼兒和老人。
劍橋SANGER中心——還是這個中心，連項目的領導者也跟上面的鼠疫桿菌是同一人——從越南弄來了一種能夠抵抗多種抗生素的傷寒沙門氏菌菌株。測序發現，它的基因組里有200多個假基因， 它們一度起過作用，但在病菌適應人體生活環境的過程中被拋棄了——而這也可能把它逼上了進化的死角。科學家希望，這種單一的口味會使它比較容易對付，只要阻斷它感染人類的途徑，就有希望根除這種疾病。在此之前，根據基因組也可以設計出更好的疫苗和診斷方法。由於傷寒的症與瘧疾和登革熱等病相似，很容易搞混。
危害及影響
夏天正是新鮮蔬果搶閘上市的時節，而在大洋彼岸的美國，這個夏天卻有不少人因生吃西紅柿被「絆倒」了——據最近統計，目前，美國已有30個州幾百人因生食了從墨西哥進口的帶有沙門氏菌的新鮮西紅柿而中毒，患者中至少48人因病情嚴重住院，其中1人死亡，而「生食療法」被視為一種健康的時尚，如今聽說生吃蔬果也會中毒，不少人十分著急：到底該如何預防？對此，專家指出，並不是所有的蔬果都越鮮吃越好，其實生吃蔬果有不少講究，有些菜涼拌前一定要用開水焯一下，徹底除塵去蟲更衛生。
疫情：美國人生吃西紅柿「中毒」
生吃西紅柿等新鮮的時蔬水果是再平常不過的事了，然而，在美國中西部和南部30個州，近日卻有數百人因生食了從超市或是餐館購買的新鮮西紅柿而出現發燒、腹瀉、腹痛等症状，這些西紅柿進口自墨西哥。有幾十人因病情嚴重需住院，甚至已有重症病人死亡。美國疾控中心通過檢驗發現，吃過這些西紅柿的患者檢查中都發現了沙門氏菌，看來，這是一起嚴重的沙門氏菌病疫情。
沙門氏菌是美國食物中毒致死的主要原因。美國人對這種病菌一點都不陌生，每年全國大約報告40000例沙門氏菌感染病例。但實際的感染人數可能要達20倍以上，因為許多輕型病人可能未確診，據不完全統計，每年大約有1000人死於急性沙門氏菌感染。但是，以前各州爆發的疫情幾乎都與人們吃了染上沙門氏菌的肉類、蛋類、乳類有關，但迄今為止，很少聽說吃蔬果大面積受沙門氏菌污染甚至在人群中引發大疫情的。對此，周福生教授解釋說，這可能是西紅柿在生長的過程中，由於空氣中紫外線不夠強烈，植物在灌溉過程或因土壤中含有沙門氏菌，這樣才使西紅柿的表皮上沾染了沙門氏菌，加上不少人有生食西紅柿的習慣，如果沒有清洗乾淨，就完全有可能發生沙門氏菌感染。不光是食用西紅柿，其他瓜果蔬菜也一樣。
美國SIDNEY KIMMEL癌症中心的科學家對鼠傷寒沙門氏菌進行測序，發現它的假基因比傷寒沙門氏菌少得多，只有40多個。此外，兩種病菌還各自擁有幾百個對方所不具備的基因。對於同屬一種的兩種生物來說，這種差異足夠讓人驚詫。已知的腸道沙門氏菌有2000種之多，有幾種已經在測序中，屆時大家彼此對照起來看，就更有意思了。
沙門氏菌檢測方法
自19世紀後期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學都是建立在採取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此後的60年間，用於從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用於臨床病料的方法是相同的。但至少有三個因素限制了用於臨床病料的方法應用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影響特定細菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經過加工的食品，由於加熱、乾燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱「致傷」。這就形成了一個具有不同生長特性的細菌群。這種現象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因為在選擇培養基上直接培養「致傷」的沙門氏菌通常是以細菌死亡和試驗失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被採用。隨著DNA和抗體技術的發展，近10～15年間發展了無數改進的方法，其中許多可以在48h內檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。
1、傳統的培養方法
用於沙門氏菌分析的傳統方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步(預增菌)，將樣品加到一種高營養、無選擇性的培養基中，溫度37℃，使那些「致傷」的細菌復甦及使所有微生物生長。雖然緩衝腖水被建議常規使用(由於其可保持溶液pH值穩定)，但對培養基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數量減少，與預增菌培養基相似，對選擇性培養基的選擇，也存在許多不同的觀點。目前應用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionatebroth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養基。由於沒有任何一種培養基可以全面地保持所有食品基質或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當的做法就是使用兩種培養基平行地進行試驗。第三步是分離步驟，即選擇性培養物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長製劑的瓊脂平板上劃線培養，然後對平板上肉眼可見的特徵性菌落進行確認，並對該菌落分離物進行一系列生化和血清學檢測，以作出鑒定。傳統沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結果。
2、以抗體為基礎的檢測方法
利用抗原-抗體反應的顯著特異性，來進行細菌的鑒別和血清學定型，已有半個多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經建立的沙門氏菌免疫學檢測方法有許多種，大致可分為以酶標抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標記抗體(放射免疫試驗)為基礎的方法及其它多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫感測器、免疫擴散及免疫色譜技術的方法。但常規中最廣泛採用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。此法改進後用有放射活性的同位素替代標記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質上的「捕捉」抗體來捕捉目標抗原，經洗滌除去未結合的成分，加入第二種酶標抗體，此者結合在捕捉到的抗原的不同位點上，第二次洗滌後加入酶作用基質，並令其與顏色成分反應，然後用分光光度法即很容易檢測到目標抗原。採用微量滴定板作為固態基質使反應形式標準化，並促成其自動化。
黎兆滾等人首次在國內口岸系統應用微量板ELISA法(Salmonelletest1)對進出口動物產品(魚粉、肉骨粉等)進行沙門氏菌檢測。該法採用預先包被了沙門氏菌(A-E群)單株抗體的微量板，加入經增菌處理的樣品，反應後再加入一定的指示劑，作用畢後用酶標儀測定OD值來判定結果。食物樣品經適當的增菌處理，也可用此法進行沙門氏菌檢測。ELISA法檢出沙門氏菌的極限範圍在105～106個細胞/ml，因此，要得出可靠的結果，食物樣品首先必需進行預增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進行後增菌，以促進鞭毛髮育。總的來說，標準的ELISA法樣品的製備，約需要經過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)樣品製備過程分步，共耗時24h：①選用營養肉湯進行預增菌(6h)，使「致傷」、冷凍的沙門氏菌復甦。②使用選擇性培養基RV進行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時抑制其它雜菌生長。③使用營養肉湯(蛋白腖水)進行後增菌(4h)，使沙門氏菌的數量大大增加。比上述標準的ELISA法樣品製備過程縮短了一半的時間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時間，90min是孵育時間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內完成，比上述方法縮短了一半的時間，頗值得推廣應用。最新式的沙門氏菌免疫學檢測法，利用經特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎。幾滴樣品加到卡片上，結果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由於無需要特殊設備，很適合小型實驗室使用。儘管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時不超過10min，如果採用黎兆滾等人的樣品製備法，則可使操作時間更為縮短。
3、以核酸為基礎的方法
細胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由於所有的細胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。標靶通常是一個特異性核酸序列，它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學方法相似，探針也需要加附適當的標記，如放射性同位素、酶或發光的標識物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DNA—RNA雜交技術，此法應用的探針含有用放射性同位素標記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經大約48h的增菌步驟後，檢測極限可達108個細菌/ml，但由於要使用放射性同位素，只能在專門的實驗室應用，此方法的優點都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎的第二代技術—比色計目前已發展起來。這種方法依賴於沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發育過程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細胞蛋白質合成器的一部分，每個細菌細胞中存在5000～20000個複製體，而相比之下染色體DNA複製體僅2～10個。這種天然富含rRNA標靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當或更高的敏感性。其另一優點是由於rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無需經過變性步驟。要得到陽性結果，此法需要105個靶細胞/ml，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進行預增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法(酶聯免疫檢測法)更耗時，但二者成本相近。食品細菌檢測法的最新進展是在化學擴增體系方面的發展，即聚合酶鏈反應(PCR)，用該體系可對製備好的樣品進行細菌DNA擴增，以便更易於用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用於檢測沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必需經選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應的某些成分。一個完整的以PCR為基礎的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優點，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌「致傷」嚴重難以復甦而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。
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