基因診斷與性病/衣原體感染症

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基因診斷與性傳播疾病

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沙眼衣原體是(chlamydia trachomatis,CT)是一種在人體內長期生存並又廣泛傳播的病原體,屬條件致病菌。它在一定條件下能引起子宮頸感染早產流產尿道感染等多種疾病,尤其是在與淋球菌等其他病原體合併感染時更加重疾病的發展及引起其它併發症,在無症状子宮頸和男、女性泌尿系統常有沙眼衣原體的存在,其檢出率不一。至今,西方國家已有10-20%的人口感染有沙眼衣原體,特別是性接觸而傳播其感染率更高,成為目前醫學所關注的重大問題之一。最近,在對我國大陸性亂人群進行檢查時發現,有相當多的人其泌尿生殖系統感染有CT,並已構成我國性傳播疾病(STDs)。

一、病原學

衣原體是一類能通過細胞濾器,有獨特發育周期、嚴格細胞內寄生原核細胞微生物。具有以下特點(1)具有DNARNA兩種類型的核酸;(2)二分裂方式繁殖,發育周期特別;(3)細胞壁成份中含有肽聚糖;(4)含有核蛋白體;(5)對多種抗生素都敏感。衣原體廣泛寄生於人類,哺乳動物及鳥類,僅少數有致病性。只有沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體可以引起人類疾病。

目前已知衣原體有15種血清型。A、B、Ba、C血清型主要引起眼疾患,D-K型引起生殖器疾患,L­1-L3型為引起性病淋巴性肉芽腫的病原體。它們嚴格稱細胞內寄生微生物,大小約300-400μm,在細胞內生長繁殖,有特殊的發育周期,感染力為基本小體,增殖力為網狀體,在電鏡下可見胞膜有絲分裂繁殖。

衣原體對熱敏感,56℃-60℃僅能存活5-10分鐘,在-70℃可保存數年。0.1%甲醛液、0.5%石碳酸可將衣原體在短期內殺死,75%乙醇殺滅力很強,半分鐘即有效,對利福平四環素紅霉素均敏感。

二、流行病學

近年來各種報導顯示,淋菌性尿道炎發病率下降,而非淋菌性尿道炎卻不斷上升,居STDs的首位。其中CT感染所致的病例顯著增加,如美國報導非淋菌性尿道炎約半數為CT所致,在淋病中有20-40%從病灶中分離出CT,另據報導男性非淋菌性尿道炎在世界急劇上升,以美國為例、一年間就300萬人患本症。女性宮頸炎等,在女性生殖器感染症中CT也是其主要的病原菌

男性非淋菌性尿道炎最常見的病原菌是沙眼衣原體。在美國異性戀男性中沙眼衣原體陽性率達40%,每年約有60萬男性患者呈持續性或複發性NGU,同時發現沙眼衣原體宮頸炎婦女其男性性伴侶的感染率為42%,患衣原體尿道炎的男性其女性性伴侶的感染率為62%,無症状的沙眼衣原體感染在性活躍的男人間傳播率更高。

引起男性不孕症的因素很多,但最近發現從無生殖力的膿性精液及男子性腺活檢標本中分離出沙眼衣原體,進一步提示和證明了沙眼衣原體引起男性不孕症的可能性。有人對淋病感染症的男性患者進行觀察,發現體內有高效價的抗衣原體抗體,衣原體陰性淋菌尿道炎者亦有高價抗衣原體抗體,並發現65-85%的非淋菌性後尿道炎是由沙眼衣原體引起。

附睾炎是男性NGU最主要的併發症,在年輕的性活躍的男性附睾炎患者中,45-60%是由沙眼衣原體引起。大多數病人有尿道症状體征,尿道標本和附睾吸取液中可分離到衣原體。

沙眼衣原體性子宮頸炎在女性衣原體感染中最多。因為感染只發生於子宮頸的柱狀上皮,而不感染陰道鱗狀上皮,故不造成陰道炎。英國去性病門診就醫的婦女衣原體培養陽性率為20-30%,微量免疫熒光法檢測血清抗體達60%。淋病患者的宮頸炎標本衣原體陽性率為30-35%,伴不典型宮頸炎或無症状衣原體宮頸感染為3-5%,說明衣原體隱性感染率和混和型感染率相當高,對宮內避孕器的應用者進行測定,發現由避孕器引起的盆腔炎症中大部分是由衣原體感染所致。在男性NGU患者配偶的宮頸中有30-60%分離出衣原體。在與感染的男性性交後約33-49%的宮頸衣原體感染的陽性患者並不表現任何症状,但持續存在於宮頸基層上皮細胞內的衣原體抗原可干擾宿主細胞DNA使之發生惡變。

研究表明,在腹腔鏡直視下採取受侵輸卵管液檢查中發現衣原體陽性率在30%左右、並發現,有40%左右的輸卵管炎是由沙眼衣原體引起的,且衣原體感染的孕婦容易發生流產,而流產後多數又引起輸卵管炎。許多臨床衣原體感染的婦女數年後出現不孕宮外孕、並發現輸卵管梗阻所致宮外孕,宮外孕和生育力低下者中沙眼衣原體抗體陽性佔81%。

沙眼衣原體的感染可引起男、女性急性尿路症候群,在已開發國家,沙眼衣原體引起的女性尿道炎的趨勢正在不斷地增加,並且正在年輕化,應引起全社會的關注。 我國沙眼衣原體感染屬於近年的事,由於臨床上較多的泌尿生殖系感染查不出病因,故引起專家們對衣原體感染的臨床研究。從1989年我國從14例性亂婦女宮頸標本中分離培養出沙眼衣原體以來,越來越多的研究表明在性活躍期的性亂及正常家庭中,沙眼衣原體的泌尿生殖道感染率在5-25%之間,特別是家庭成員之間的傳播更應引起重視,不少兒童性NGU是由沙眼衣原體的感染引起的。

三、傳播途徑

男性非淋菌性尿道炎約30-70%可通過性交傳染給女性,反之亦有25-50%患有衣原體性宮頸炎的女性經性交亦可傳給男性。新生兒由母體垂直感染,發生衣原體性結膜炎,有10-20%發生肺炎,女性感染CT還有由宮頸炎上升而並發腹腔內諸器宮感染。由於「口交」亦能引起口腔內衣原體感染。另外,由宮頸、輸卵管處分離出CT的事實,也可說明其傳播途徑。

應該說明一點:當今有些所謂NGU與性行為並無關係,如醫源性感染(尿道插管、膀胱鏡以及外傷化學性刺激等)。還有所謂NGU並非是由衣原體性微生物所致,在含義上應該與NGU加以區別,因為病原體不同,而傳播途徑也有所不同,故醫生在診治中要心中有數。

四、發病機理與免疫

衣原體感染人體後,首先侵入柱狀上皮細胞並在細胞內生長繁殖,然後進入單核巨噬細胞系統的細胞內增殖。由於衣原體在細胞內繁殖,導致感染細胞死亡,同時尚能逃避宿主免疫防禦功能,得到間歇性保護。衣原體的致病機理是抑制被感染細胞代謝,溶解破壞細胞並導致溶解酶釋放,代謝產物的細胞毒作用,引起變態反應自身免疫

當人體感染衣原體後,產生特異性的免疫,但是這種免疫力較弱,持續時間短暫,因此,衣原體感染容易造成持續,反覆感染,以及隱性感染細胞免疫方面,大部分活動性已治癒的衣原體患者,給予相應的抗原皮內注射時,常引起遲髮型變態反應。這種變態反應可用淋巴細胞進行被動轉移。此種免疫性很可能是T細胞所介導。體液免疫方面,在衣原體感染後,在血清和局部分泌物中出現中和抗體。中和抗體可以阻止衣原體對宿主細胞的吸附,也能通過調理作用增強吞噬細胞的攝入。

五、臨床表現

(一)男性衣原體性尿道炎(chlamydia urethritis,CU)

又稱為非淋菌性尿道炎(NGU)。是由衣原體感染引起的非急性化膿性尿道粘膜炎性病變。目前已成為STDs中最常見的一種。

本病潛伏期比淋病長,約1-3周或數月,主要表現為尿道內不適,刺痛及燒灼感,並伴有不同程度的尿頻尿急尿痛,尿痛較淋病為輕。尿道口輕度紅腫並有漿液或粘液膿性分泌物,稀薄而量少,長時期不排尿或早晨首次排尿前可見尿道口分泌物污染內褲,並可見尿道口有「糊口」現象;分泌物少時,於晨起擠壓尿道才流出少量粘液。合併膀胱炎時可有血尿;無症状性非淋菌性尿道炎,約30-40%病人症状不典型或根本無症状。約1/3左右的淋球菌尿道炎病人合併沙眼衣原體感染,淋病治癒後又出現尿道炎症状,易誤診為慢性淋病或PPNG菌株感染。

沙眼衣原體感染易並發附睾炎,表現為附睾腫大,變硬及觸痛,多為單側,部分患者的抗沙眼衣原體抗體升高,可直接從附睾抽吸液中分離出沙眼衣原體;累及睾丸可出現睾丸炎,表現為睾丸疼痛、觸痛、陰囊水腫輸精管變硬變粗;累及前列腺時可出現後尿道、會陰肛門部位鈍痛或觸痛,可有性功能障礙,直腸鏡檢可觸及有壓痛的前列腺。如前列腺明顯腫大,可壓迫後尿道而出現尿流變細、排尿無力尿流中斷等;本病還可以合併Reiter症候群,即關節炎,結膜炎,尿道炎三聯症。

(二)女性生殖系統衣原體感染症

女性感染衣原體不限於尿道,可累及整個泌尿生殖器官,此類感染常因缺乏自覺症状或症状輕微而忽視了治療,造成傳染源而擴散,形成危害。

女性衣原體感染比男性感染引起的症侯要多,其主要感染部位為宮頸,由此垂直感染給新生兒,以至發生PID等,其後遺症多導致不孕症。

無症状感染(缺乏症状反應):由於本病缺乏自覺症状,則局部病象便成為診斷的一個重要指標,表現為陰道有膿樣分泌物,亦可為粘液或漿液性。分泌物量較多(為中等量),稍有臭味。陰道粘膜為正常顏色,但常伴有宮頸糜爛

衣原體性宮頸炎:當伴發宮頸炎時、宮頸發紅,有漿液或膿性分泌物增加、陰道內糜爛擴大,易於出血等症状。鏡檢下陰道分泌物的所謂「陰道清潔度」多為III度以上。沙眼衣原體主要侵犯宮頸的柱狀上皮細胞,而磷狀上皮細胞常不被侵犯,故陰道,宮頸局部沒有改變。

宮頸炎的主要症状是白帶增多,不時出血及小腹部疼痛等一般症状,無特異性表現,多因其性伴患有尿道炎而來院就診。

衣原體性輸卵管炎,本症多由宮頸炎並發引起。用腹腔鏡直接從輸卵管抽吸物標本中,約30%以上檢測出衣原體,病情經過多數較輕、下腹部可有輕微疼痛,一般體溫不高,但血沉稍快。由於這種非典型經過,使病人拖延就醫,往往引起子宮附件損害,形成輸卵管炎的後遺症,其最主要表現是輸卵管性不孕症。

盆腔炎(PID):PID不是固定疾患的用語,凡在盆腔內感染症,如宮內感染,輸卵管炎等附件炎症波及盆腔腹膜特定的部位感染均可稱之為PID,由CT引起的PID主要是由宮頸炎上行感染所致。其主要表現是急腹症型。

部分患者可導致宮外孕、流產、不孕、死胎及新生兒死亡。有些病人除不孕外,可無任何症状。也可通過產道傳染,引起嬰兒眼結膜炎、鼻炎中耳炎、肺炎及陰道炎等。

六、診斷與鑒別診斷

診斷衣原體性疾患,目前在我國尚未普及,因此,往往漏診,所以應當重視臨床表現,爭取做到化驗室檢測指標求得確診。

患者來就醫時,男性主訴常常是尿道疼,不適感或從外尿道流出膿樣粘液,或因患「淋病」久治不愈,反覆出現上述現象;女性病人常常無症状,只是白帶多或因其丈夫有「淋病」史,特意來檢查確診。

(一)臨床症状

首先應排除淋菌性尿道炎

衣原體性尿道炎與淋菌性尿道炎鑒別

臨床病症 沙眼衣原體 淋球菌
潛伏期 1-3周 2-5日
發病 緩慢 突然
尿路刺激征 輕或無 多見
全身症状 偶見
尿道分泌物 少或無,粘液性或漿液性稀薄 常見,量多呈膿性
無症状帶菌者 相當多 有,但不多
白細胞內G-雙球菌 (一) (+)
病原菌培養 沙眼衣原體 淋球菌

(二)實驗室診斷

檢測出病原體或病原體特異性DNA是診斷本病唯一標準,近年來由於對CT直接分離培養成功,加之基因診斷技術在CT診斷方面的成功應用,使過去認為難以診斷的疾患已提高到最易診斷的一種疾患,但是上述兩項技術特殊,對操作人員及實驗設備要求嚴格,在一般醫院實行起來尚難完成。一般只用CT抗原法進行診斷。

1.衣原體細胞培養:對沙眼衣原體敏感的細胞株為McCoy細胞、Hela-229細胞和BHK細胞,最常用的是經放線菌酮處理的單層McCoy細胞,孵育後,用單克隆熒光抗體染色,可迅速診斷,但操作人員一定要熟練,需專業培養。培養法的敏感性為80%-90%,陽性即可確立診斷。

2.衣原體細胞學檢查法:在感染細胞內可有衣原體的包涵體存在。從感染部位採取細胞標本作塗片,姬姆薩染色包涵體是藍色或暗紫色,碘染色顯示褐色。但敏感性差(40%),目前已較少採用。

近年來採用熒光素標記的抗衣原體單株抗體,來檢測細胞塗片中的衣原體,使用較為方便,目前主要用衣原體外膜蛋白(MOMP)的單株抗體的商品試劑(Mico Trak,Pathfinder,Monofluor)。結果判斷:要衣原體數>10個才能判為陽性。

3.PCR檢測衣原體DNA:

(1)標本的處理:

①取材部位為子宮頸管,男性為尿道,將滅菌白金耳深入宮頸管或尿道1cm左右,轉動數圈,停留約30s,取出後置標本緩衝液中。

② 衣原體DNA提取:

將宮頸管內或尿道內刮取物置含0.5% NP-40、0.5%Tween 20,1% SDS和2mg/ml 蛋白酶K的TES緩衝液(50mmol/L Tris-HCl,50mmol/l NaCl,100mmol/L EDTA,pH 8.0)置37℃裂解60min,沸水5min,酚、氯仿抽提DNA,乙醇沉澱,沉澱物溶於20μlTE緩衝液(100mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0)。

(2)引子設計:

引子對選自衣原體16SrRNA基因,為衣原體屬特異性,以DNA合成儀固相亞磷酸三酯合成並純化。引子對的序列分別為5′GTGGATAGTCTCAACCCTAt 3′(16SrRNA基因位點832-851)和5′TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3′(位點1041-1022)。目的擴增片段(832-1041)長210bp。

(3)PCR擴增:

傳統的方法反應體積為100μl,含5x反應緩衝液20μl和FD-DNA聚合酶2U、4種dNTP各200μmol/L以及引子對各25pmol/L。上述成分預先一次性分裝於0.5ml離心管,-20℃備用。臨用加模板DNa 2μl,短暫離心,加100μl礦物油覆蓋。現在試劑已商品化,反應體積為25μl,單管已分裝好,只要加入模板DNA即可。置DNA擴增儀進行40次循環擴增。每次循環包括90℃變性45s(第一次循環變性2min),55℃退火30s和72℃延伸40s(最後一次循環72℃,延伸5min)三個步驟。每次擴增均應作陰陽性對照。

(4)擴增產物的檢測

① 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測:取10u l PCR擴增物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳、0.5μg/ml溴化乙錠染色,以PGEM-3Zf(+)DNA-Hae Ⅲ為分子量標準,置紫外透射儀觀察結果。

生物素寡核苷酸探針的檢測

a.探針序列及合成:探針序列為5′ACTCAA-AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAa3′(30mer),衣原體16Sr RNA基因中的位點為909-938,與PCR擴增片段中間序列互補。以DNA合成儀固相亞磷酸三酯法合成並純化。

b.標記:按Riely等方法略有修改。以末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)催化Bio-11-dUTP標記到合成的寡核苷酸探針片段3′-OH端。反應體系含:140mmol/L二甲胂酸鈉,30mmol/l Tris-HCl(pH 7.6),100μmol/L Bio-11-dUTP,0.1μmol/L 寡核苷酸片段,0.05%BSA,300U/mlTdT。於37℃保溫3h後,加10mmol/LEDTA終止。寡核苷酸片段探針標記後,將標記探針(1ng/μl)作2倍系列稀釋,取5μl點膜,封閉後顯色。結果探針經32倍稀釋(最高稀釋度5ng)後仍呈現明顯的顯色反應,證實探針的標記以及顯色效應良好。

c.DNA斑點雜交:提取的DNA或其PCR擴增產物0.5mol/l NaOH變性20min,取5μl點於硝酸纖維素膜,烘乾;以6×SSC(1xSSC為:0.15mol/l NaCl,0.015mol/L檸檬酸三鈉,pH 7.0)浸泡2次,80℃干烤2h。置6×SSC,5×Denhardt液,0.2%SDS,50μg/ml變性牛胸腺DNA,10mmol/l EDTA中於55℃雜交3h後,加入終濃度為150μg/ml的探針,於55℃雜交過夜。以2×SSC-0.1%SDS室溫漂洗3次,每次min。

d.顯色:將雜交漂洗後的濾膜浸泡於0.1mol/l Tris-HCl (pH7.5),0.15mo l/L NaCl,0.05%Tween20,0.05%%TritonX-100,2%BSA中,37℃封閉6min;置4μg/ml親和素的緩衝液A(0.1mol/l Tris-HCl,0.15mol/LNaCl,pH 7.5)中,37℃孵育30min,緩衝液A漂洗3次;再置於含1μg/ml生物素化鹼性磷酸酶的緩衝液A中,37℃作用30min,緩衝液A漂洗2次,緩衝液B(0.1mol/lTris-HCl,0.1 mol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH 9.5)漂洗2次。最後將膜泡於含0.1mg/ml磷酸萘酚AS-MX和0.6mg/ml堅固藍RR的緩衝液B中,暗處顯色30min。

PCR擴增衣原體DNA有十分高的特異性及敏感性,結合生物素標記的衣原體寡核苷酸探針作DNA斑點雜交。可作為衣原體診斷的金標準,其敏感度可以檢測相當於1個拷貝的衣原體DNA分子

七、治療

衣原體對作用於細胞壁的藥物耐藥,如青黴素類萬古黴素桿菌肽,對於抑制膜蛋白和胞漿蛋白合成藥物敏感,如四環素、紅霉素等。

治療方案

首先四環素類,四環素500mg每日4次,連服7天,或用強力黴素100mg每日2次,連服7日。對四環素禁用或耐受性差的患者,可改服紅霉素500mg,每日4次,連服7日,復方新諾明亦有效。

另外近年來新開發的對各領域的感染症廣泛使用的新藥喹諾酮類,在治療衣原體方面臨床效果較好,其中常用的藥物有氧氟沙星(OFIX),環丙沙星(CPFX),洛美沙星,利福賓士療效果也較好。

治療中應注意的問題:

(1)四環素類藥物妊娠婦女有致畸作用,故應禁用。

(2)從目前臨床觀察來看用喹諾酮類藥物比應用四環素類藥物為好,因為患者多數有淋球菌或其它合併感染。

(3)治療時間2-3周為宜。衣原體繁殖周期為48-72小時,寄生在細胞內,藥物滲入細胞內的濃度一般較低。所以治療時間需要長些。

(4)在男女感染後無症状或症状輕微者,可視為帶菌者,應接受正規治療。對患者的性伴要同時治療。

(5)聯合用藥:四環素類+喹諾酮類

紅霉素類+喹諾酮類

四環素類+利福平

喹諾酮類+利福平

參看

32 非淋菌性泌尿生殖道炎 | 支原體性感染症 32
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