基礎檢驗學/先天性遺傳性疾病的產前診斷
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先天性疾病包括遺傳性疾病，即親代的病態基因經生殖細胞配子結合形成合子時傳給子代的疾病，和非遺傳因素，如一些在配子形成，染色體聯會時的基因突變，受精卵以育等過程中由於某些外在因素的影響而引起和疾病。這類疾病表現為患兒智力，器官結構和功能和種種缺陷。
產前診斷中可將先天性遺傳性關病分為三大類：
1．染色體病：由於遺傳或環境因素引起染色體的數目及結構上的異常造成的疾病。在臨床上可發現新生兒的有多種畸形並常伴有智力障礙。這類病紅占出生總數的0.5%，產前診斷的25-50%。
2．單基因遺傳病：僅有一對基因發生突變或異常引起的疾病。絕大多數表現為酶的缺陷。臨床上稱為先天性代謝病。目前能用生化方法診斷的約有300種，其中50%為常染色體顯性遺傳，40%為常染色體隱性遺傳，10%為性連鎖遺傳全以X伴性遺傳為多見。一般占出生總數的1.8%，產前診斷的6-10%。
3．多基因遺傳病：兩對以上的多對基因突變。各對基因呈共顯性，每對基因的作用是微小的，但若干對基因作用積累，或形成一個明顯的效應，在臨床上出現一個病狀群，主要表現為一些先天畸形，如唇、齶裂和畸形足、脊柱裂、無腦兒、神經管畸形、幽門狹窄、先天性髖關節脫位、先天性心臟病等，這類病占出生總數的2.6%，產前診斷的40-50%。某些多基因異常遺傳病，如I型糖尿病、高血壓病、冠心病、哮喘、精神分裂症等常是遺傳因素與環境因素共同作用的結果，它只能從群體調查和空族系譜的發病率中了解其分布及復現率。
一、染色體病核型分析
核型分析主要用於檢查染色體因婁衢虞結構異常而造成的遺傳性疾病。一般是將新鮮的羊水20-30毫升，經離心得到羊水中的細胞，經RPMI1640培養液與25%小牛血清中培養8-10天後，以秋水仙素處理，使細胞均停止在M期，經獲得分裂相細胞，將細胞經低參、固定、製片處理後，進行Giemsa染色或用顯帶染色，然後進行核型分析。
（一）性染色質檢查
羊水細胞性染色質的檢查有助於診斷性連鎖性遺傳病(sex linked inheritance disease,)如甲、乙型血友病，原發性低丙種球蛋白血症，自毀容貌症候群，肌營養不良，G-6PD缺乏症。粘多糖沉積病二型，糖原代謝病二型如果父親為X-連鎖隱性基因攜帶者，攜帶者，父親正常，則男胎一半正常，一半工半為患者；女胎一半正常，一半為基因攜帶者，可根據檢測結果決定是否繼續妊娠。常規的檢查方法是將羊呂10毫升注入離心管，以1000r/min1離心0min棄上清，管底沉澱物加甲醇冰乙酸液8ml固定30min，按前述條件離心棄上清，再加少許新鮮固定液製備成細胞懸液，取1-2滴於載玻片上，空氣中乾燥待染色。
羊水細胞製片選用於：①X染色質檢查（examination of X chromatin 或Barr rest）：一般採用硫瑾或甲苯胺藍染色，經油鏡觀察。鏡下可見到兩類細胞核，一類核大，核膜完整，結構清晰，染色質均勻，稱可數細胞；加一類核小固縮或染色過深，結構分辨不清或核重疊，有破損，為非或細胞。在可數細胞的核膜內緣處，見到呈深藍色的三角形，半圓形或饅頭形的染色質塊，其大小約1.2μm×0.7μm 左右，即X染色質，記錄X性染色質的細胞當選目算出其百分率。X染色質≥6%者判為女胎，≤5%者判為男胎。②Y染色質的檢查採用阿的平熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可崢細胞核的偏中心部或近核膜處有 0.3μm大小的熒光弧狀圓點，輪廓清晰，較其周圍的核質熒光屏光為強，有時熒光點過大或過小，所發熒光很強，與其餘核質所熒光分開，這種熒光小體就是Y染色質。當熒光點過大或過小，所發熒光很弱與核質熒光無區別時，則不是Y染色質。選擇核均勻，核完整清晰的可數細胞，計算出有Y染色質細胞的百分率，Y染色質細胞≥5%診斷為男胎，<4%婦胎。如羊水細胞中X、Y小體同時大於等於5-6%應考慮是否為性染色體數量異常，此種病例應直一步分析核型。
（二）、性別基因診斷
目前隨著基因的診斷技術發展，胎兒性別診斷有了更準確、更靈敏的方法，使對於性連鎖疾病診斷的正確性可靠性大為提高。最常用的方法是：
1．Y特異DNA探針對人性別診斷，有關Y染色體DNA的探針有多種，如PHY3.4，PHY2.1等，目前最公認的是Y染色體特異的SRY基因，在男性性別決定中起關鍵作用。將羊水細胞用細胞裂解液解後，點於硝酸纖維膜上與32P標記SRY基因探針直接進行斑點雜交，或將羊水細胞DNA經0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離後進行Southern印跡雜交，凡出現雜交斑點或代的為男性，不顯示或顯示極弱者為女性。
2.PCR基因擴增法測定性別以常規蛋白酶-SDS-酚法提取羊水細胞DNA0.1-1.0μg或直接羊水細胞裂解得到DNA為模板，進行PCR基因擴增測定胎兒性別，用於產前診斷胎兒性別的Y染色體基因有4種：DYZ1，DYS14，ZFY和SRY。目前認為SRY是睾刃決定因子的最佳候選基因，以兩對SRY基軒HMGRox保守序列的引子進行DNA擴增1.5%瓊脂糖電泳，溴化已錠染色，根據фXHae分子量標準，男性胎兒在分子量為271bp處可見一SRY特異區帶。
三、生化及免疫學檢查
羊水是清液的生化及免疫學檢查主要用於遺傳性代謝的病的檢測。目前已知的遺傳性代謝病有3000多種，有89種可進行產前診斷。這些先天性代謝病產前診斷方法大都比較複雜。目前臨床實驗室能夠開展一些簡單方法主要用於粘多糖沉各種積病，開放性神經管缺陷和某些酶缺陷的檢查。
（一）粘多糖沉積病的檢查
粘多糖沉積病是由於細胞溶酶體酸性水解酶先天性缺陷所致。根據病因目前本病可分為八大類型，我國已報告200從余例，主要表現為嚴重的骨骼畸型、腫脾腫大，智力障礙以及其它畸形。粘多糖沉積病產前診斷以測定培養羊水細胞內特異的酶活力最為可靠，但實驗要求高，一般實驗室難開展。兩種較簡單的實用的方法是甲苯胺藍定性及糖醛酸法半定量測定。
1．甲苯胺藍定性：方法同尿液粘多糖檢查。妊娠早期羊水正常者可呈陽性，妊娠中後期為陰性如陽性提示胎兒患粘多糖沉積病。
2．糖醛酸半定量測定：羊水中酸性粘多糖與四硼酸鈉硫酸溶液反應生成糖醛酸，以每毫無肌酐中糖醛酸的量反映酸性糖多糖的多少。隨著妊娠的進展，糖醛酸含量逐漸減少，妊娠16-20周的參考值為3.3-7.0mg/mgCr，如高於此值應考慮有粘多糖沉積肥病。本法除Morguio症候群外對其它類型的粘多糖沉積病均有診斷意義。
（二）神經管缺陷的檢查
1．甲胎蛋白測定神經管缺陷在產前診斷中佔有很大的比例。而羊水甲胎蛋白的測定目前診斷神經管缺陷的常規方法。AFP主要在胎兒肝臟及卵黃囊內合成，羊中AFP來自胎兒尿，小部分來自胎兒胃腸道信羊膜，絨毛膜細胞。正常妊娠羊水中AFP在妊娠15周時最高，可達40mg/L，20-22周逐步下降，23周後穩定下降，32周後降至25mg/L並一直維持此水平至足月。開放性神經管缺陷的胎兒，如無腦兒和脊柱裂，胎血內的AFP可從暴露的神經組織和脈絡叢滲入羊水，使AFP高於正常10倍以上。羊水中AFP測定對胎兒神經管缺陷診斷屬非特異性的檢查。胎兒血中AFP含量比羊水高150-200倍，故穿刺傷及胎兒及胎盤，可出現假性升高此點必須注意。AFP測定需將妊娠中期羊水上清稀釋100倍後，按血清AFP免疫學方法測定。
AFP除用羊水檢測外亦可用母體血篩查，診斷開放糖果經管畸形的準確率達90%以上，因此具有特殊診斷價值。此外胎兒其它畸形如先天性腎疾病、食道閉鎖、腦積水、骶尾畸形瘤、染色體異常，糖尿病，先兆子癇等各種原因引起的胎盤功能不足，流產，胎死宮內等，羊水AFP也可升高。
2．羊水總膽鹼酯酶測定：常用於確認升高的羊水AFP水平。羊水含有的膽鹼酸酶依其對乙醯膽鹼的親和力差異，分為真性膽鹼酯酶和假性膽鹼酯酶兩種。胎兒早期機體內即已合成CHE，於妊娠12周時可測得羊不中CHE顯著升高，當胎兒神經稍不成熟時，從胎兒的禽脊液和血液滲出到羊水中的CHE比成熟時為多，故做為羊水TCHE測定，可用於對開入性神經管缺陷的診斷。測定方法為用丙醯硫代膽鹼或乙醯硫代鹼用為底物，5，5-二硫代雙為顯色劑的速率法或終點法。
3．羊水中真性乙醯膽鹼酯酶測定羊水中真性乙醯膽鹼脂酯活性能增加與胎兒開入性神經管畸形高度相關，ACHE定性的聚丙烯醯胺凝臁電泳分析是當前常用的方法，特別是對於神經管畸形可疑症的確診。該方法首先經PH8.1電泳將PCHE和ACHE分開，再根據酶學反應原理，與CHE底物乙醯硫低膽鹼和反映示劑共同溫育，CHE分解底物產生的硫代鹼膽與銅離子反應形成複合物，在酶區事業出現白色沉澱線。正常羊水電泳後可見一條慢速的PCHE區帶，快速的ACHE區帶極微。開入神經管缺陷羊水可見明顯的快泳的ACHE區帶，而同時平等加入ACHE特異抑制劑BW284C51的樣品電泳後，可見此ACHE區帶消失。ACHE定性電泳時一定要做陽性與陰性對照，以保證結合判斷準確無誤，漲膠電泳分析為無腦畸形和開入性脊柱裂的篩診陽性率可達到99.5%，但胎兒患臍疝流產和其它嚴重先天畸形進羊水ACHE也可陽性。因此對於診斷結論，決定是否完成或終止妊娠必須結合其它檢查綜合考慮。
1．γ-谷氨醯轉移酶測定：正常妊娠羊水GGT活性以妊娠14-15周時最為高，約為母體血漿的10-100倍，然後漸降，至胎齡30-40周時，只有15周時的1/40。於15周左右測定GGT的產前的早期診斷胰腺纖維囊性變的最佳指標，預測準確性達77-84%，GGT下降的原因是富含GGT的小腸微絨毛停止發育或有酶的抑制物釋入羊水所至。此外胎兒的染色的體病，如21三體或18三體症候群畸胎GGT也明顯的下降。
2．鹼性磷酯酶測定羊水ALP在妊娠19周左右活性最高，然後漸降，至29周後活性降至產前水平。在妊娠16-24周羊水ALP中3/4為小腸型，1/4為肝、骨、腎型。胎兒胰腺纖維囊性變時由於腸粘膜表面微絨毛異常而致小腸型ALP極度下降，此外可協助診斷此外21三體18三體症候群畸胎也可見ALP活性降低。
（四）死胎的檢查
1．肌酯激酶測定羊水CK活性與胎齡無關，在正常孕婦羊水中約為其血清濃度的1/5或更低，主工為CK-BB。羊水中CK升高主要來源於死胎組織的骨骼肌分解，所以CK活性與死亡時間呈正相關，而且是CK-MM升高。此外畸胎瘤、腹裂或無腦畸胎羊水的CK-BB含量亦可升高。
2．乳酸脫氫酶測定死胎羊水LD活性明顯升高，但由於宮內組織損傷，羊水受紅細胞污染等均可引起羊水LD增高，故特異性不強。
四、羊水細胞內酶分析
採用微時測定法測定羊水細胞中某種酶的活性，診斷胎兒是否有此種酶的異常。方法是將羊水細胞放在鋪有聚酯膜的塑料培養皿中培養8-14天，待細胞生長到1000-10000個時，迅速將長有細胞的培養皿冰凍乾燥，然後在顯微鏡下將其切成含10-20個細胞的小片，在石蠟的保護下，將其與少量底物保溫，當細胞和底物發生反應後，用毛細管吸出已形成的熒光顯色產物，在顯微分光光度計或顯微熒光光度計下進行測定。酶缺陷純合子者不顯色。雜合子者顯色較正常對照減低。
五、基因工程用於產前診斷
1．DNA分子雜交法，用已知的一段互補DNA作為探針，經放射標記後與羊水細胞的DNA進行印跡雜交，並用放射自顯影法得出結果，來診斷胎兒的遺傳性疾病，如用珠蛋白α基因片段兩個探針檢測α珠蛋白生成障礙性貧血。
2．限制性內切酶多態性位點的連鎖分析DNA限制性內切酶能識別特定的鹼基順序，因而能在只別位點特異地把NDA切割成各種一定大小的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳的分離，直接用溴化乙錠顯色或用Southern印跡法把這些NDA片段轉移到硝酸纖維膜上，再與已用核素標記的特異基因探針進行NDA分子雜交，採用放射自顯影技術，顯示出相應的NDA片段，從而可鑒定出是否有基因缺失或異常，例如中國人β珠蛋白生成障礙性貧血的RELP連鎖分析。
3．利用PCR技術擴增NDA探測致病基因利用PCR技術可將一個基因拷貝放大10萬倍，所得大量均一的NDA再用寡核苷酸探針雜交，放射自顯影和酶切位點分析探測致病基因。至今利用PCR可推測的遺傳病約有50多種。
以上這些分子生物學技術已廣泛用於遺傳性疾病的產前診斷如鐮狀細胞性貧血，Bart水腫胎兒、HBH病信其它α珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者、β珠蛋白生成障礙性貧血、甲型血友病、α-抗胰蛋白酶缺乏症苯丙酮尿症、杜氏進行性肌營養不良、視網膜母細胞瘤、Wilson病、Huntington舞蹈病等，做為先天性遺傳性疾病的診斷技術必將有廣泛的應用前景。
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