基因診斷與性病/愛滋病診斷

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基因診斷與性傳播疾病

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基因診斷與性傳播疾病目錄

一、診斷依據：

（一）流行病學及臨床表現

（二）實驗室檢查

（1）主要是中度以上細胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴細胞耗竭：T淋巴細胞功能下降，外周血淋巴細胞顯著減少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人為1.25～2.1），遲髮型變態反應皮試陰性，有絲分裂原刺激反應低下。

（2）B淋巴細胞功能失調：多克隆性高球蛋白血症，循環免疫複合物形成和自身抗體形成。

（3）NK細胞活性下降

（4）各種致病性感染的病原體檢查如PCR。組織學證實的惡性腫瘤，如KS；

（三）HIV 抗體檢測

1.酶聯免疫吸附法（ELISA）；2.明膠顆粒凝集試驗（PA）；3.免疫熒光檢測法（IFA）；4.免疫印跡檢測法（Western Blot，簡稱WB法）；5.放射免疫沉澱法（RIP）。其中前三項常用於篩選試驗，後二者用於確證試驗。HIV感染後數周或數日內常不能檢出抗體，95%的受染者在5個月內可測出抗體。但也有感染後3-4年仍不能檢出抗體者，此時有必要檢測HIV病毒。

（四）PCR技術檢測HIV病毒

1．標本的採集與模板核酸的製備。從懷疑為AIDS和ARC患者以及無症状的同性戀者採集血液標本，分成兩份，其中一份送往檢測實驗室與Glyciegel混合進行常規檢驗或者在-20～-80℃保存。另一份可在凍存之前通過聚蔗糖（Ficoll）離心分離，收集沉積細胞。此法亦適用於疑為HIV感染的母親及出生6個月以上的新生兒的血液標本。

可採用下述方法自血液標本中分離外周血單核細胞（PMC）：

① 取4ml血液用Hanks液1：1稀釋。

② 向含有1份淋巴細胞分離液的試管內輕輕加入兩分稀釋的血液，勿攪亂分層。

③ 2500r/min離心20min。

④ 吸出介於淋巴細胞分散液和血漿層間的PMC層，再用Hanks液洗兩遍。

⑤ 加入RPMI-1640生長液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使細胞濃度為2×106/ml。

⑥ 置5%CO2的孵箱內於37℃培養2～3d，作為HIV分離的靶細胞。

2．模板核酸的提取。製備PCR模板核酸有多種方法，但其基本原理大致相同，使用的試劑因採取的方法不同而異。這裡分別介紹兩種從外周血單核細胞中提取DNA和RNA的方法。

（1）從外周血單核細胞中提取DNA

方法A：

①取1ml經37℃快速解凍的Glyciegel凍存細胞置一支小離心管內。

②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

③2500r/min離心10min，棄上清。

④沉澱的細胞用PBS洗兩次，最後將細胞懸浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使細胞濃度為6×106/ml。

⑤加入等體積的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。

⑥　於37℃保濕後置冰箱保存。

該方法也適用於無Glyciegel保存的肝素標本及新鮮樣品經聚蔗糖-400離心製備的淋巴細胞DNA的提取。

方法B：

①取4ml經37℃快速解凍的Glyciegel標本。

②2500r/min離心10min，收集沉澱的細胞，上清液可作血清學研究用。

③用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）將沉澱的細胞洗一次。

④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗兩次。

⑤通過聚蔗糖-400離心，分離單核細胞。

⑥將單核細胞懸浮於0.5ml裂解緩衝液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使細胞裂解。

⑦用酚一氯仿抽提兩次，將水相轉移到一支新的離心管內。

⑧加入3倍體積的無水乙醇，於-20℃放置20min，13000r/min離心10min，棄上清，沉澱物經真空乾燥後，用100μl蒸H2O溶解，於-20℃保存。

該方法也適用於標本經聚蔗糖-400離心製備的單核細胞DNA的提取。

（2）從外周血單核細胞中提取RNA及其反轉錄

方法A：

① 5ml血液標本，通過聚蔗糖-400離心製備外周血單核細胞。

② 將細胞懸浮於10mlRPMI-1640離心製備外周血單核細胞。

③ 2500r/min離心20min，收集沉積細胞。

④把細胞懸浮於一定體積的預冷的裂解緩衝液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使細胞濃度為104/ml。

⑤ 13000r/min，於4℃離心10min，收集上清液。

⑥ 把含有RNA的上清液轉移到一支新管內，立即置-80℃保存，備用。

在RNA反轉錄前，先將RNA樣品用DNase處理，除去樣品中殘留的DNA。經反轉錄得到的cDNA即可進行PCR擴增。RNA反轉錄操作如（7）～（9）。

⑦ 取10μlRNA樣品加2.7UDNase I。

⑧ 於37℃保溫10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷卻。

⑨ 另將一份DNase I處理過的RNA樣品，加入RNase A（15μg/份），37℃保溫10min，置-20℃保存。

方法B：

①取5ml新鮮血漿置一支離心管內。

②40000r/min，4℃離心10min，收集沉澱。

③將沉澱物溶於變性液（4.0mmol/L異硫氰酸胍,25mmol/L檸檬酸緩衝液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巰基乙醇）中充分混勻.

④加入30μl2mmol/L乙酸鈉緩衝液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/異戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

⑤13000r/min離心20min.

⑥輕輕將水相轉移到一支新管中.

⑦加入3倍體積的無水乙醇,-20℃放置1h左右.

⑧13000r/min,4℃離心15min,收集沉澱.

⑨沉澱物用75%乙醇洗滌兩次,真空乾燥.

⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反轉錄.

⑾ 取10μl RNA樣品.

⑿ 加入10μl 1×PCR緩衝液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明膠),各0.2mmol/L四種dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制劑(RNsin),10U的AMV逆轉錄酶。

⒀ 42℃保溫30～60min,然後93℃5min.

⒁ 立即置冰浴中冷卻，備用。

由上述方法製得的RNA反轉錄樣品，通過10%聚丙烯醯胺凝膠電泳可鑒定其特異性。

二、PCR擴增步驟

（一）引子的設計與合成

HIV PCR引子設計應遵尋引子設計的一般原則。由於HIV基因易發生變異，因而引子應在保守區內設計，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列內設計，HIV感染的細胞往往很少，要從106個正常細胞中檢出1個HIV感染細胞，PCR擴增的引子首先要具有特異的結合HIV相應基因能力，同時一般要採用巢式-PCR方法，來提高檢測的靈敏性。

檢測HIV引子的第二步驟就是擴增HIV感染細胞中的原病毒DNA。感染細胞與未感細胞混合得到連續的10倍感染細胞的稀釋液。通常由103/106個感染細胞稀釋至1/106個感染細胞。同時用其它逆轉錄病毒感染細胞的DNA作對照，進行PCR擴增。然後通過Southern雜交及DNA序列分析，進一步確定擴增產物的特異性。

已經被確定的保守區是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用於臨床標本檢測之前，要對引子的特異性進行鑒定。通常取100pg含有HIV基因組序列的質體DNA稀釋液和2μg載體鯡魚精DNA。如引子是特異的，它們就會指導單一的雙股DNA片段的合成。合成的DNA片段相對應於兩引子5′末端之間距離。如果是另一種DNA模板，就不會合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所預期的或除了有所預期的片段還有其它的DNA片段，那麼可以考慮對PCR的條件進行某些改進，看是否能改善其特異性，否則要另選引子。

表6-20 用於HIV PCR擴增的引子及探針

引子及探針	序列（5′3′）	基因區	片段（bp）
SK38	ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT	gag	115(HIV1)
SK39	TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19(P)	ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145	AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT	gag	141(HIV1)
SK101	GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC		139(HIV2)
SK102(P)	GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145	AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT	gag	142(HIV1)
SK150	TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC		139(HIV2)
SK102(P)	GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O-1	GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC	gag	525(HIV1)
O-2	TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I-2	TTGGTCCTTGTCTTATGTCC	gag	422(HIV1)
I-1	TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55	CCTGCTATGTCACTTCCCCT	gag	190(HIV1)
GK56	TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P-1	TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT	pol	355(HIV1)
P-2	TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29	ACTAGGGAACCCACTGCT	Itr	105(HIV1)
SK30	GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31(P)	ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13	TGGCGCCCGAACAGGGAC	LTR	168
P14	TACCCACGCTCTCGCAG
SK89	AGGAGCTGGTGGGGAACG	LTR	165(HIV2)
SK90	GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91(P)	TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68	AGCAGCAGGAAGCACTATGG	env	142(HIV1)
SK69	CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70(P)	ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1	ACAATTATTGTCTGGTATAG	env	135(HIV1)
CO2	AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3(P)	TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71	TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA	env	320(HIV1)
CO72	TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75(P)	GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA

（二）PCR擴增步驟

1．擴增條件

當選擇的引子影響其特異性和擴增效果時，首先應考慮擴增的條件是否適宜。這些條件包括退火溫度，PCR循環數，反應物濃度等。擴增的條件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/ldNTP,每100μl反應體積2～4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,擴增25～30循環,退火溫度為37℃,引子濃度6μg/ml。在37～55℃之間變更退火溫度可以找到提高產量和特異性的最佳溫度.儘管每個實驗室使用的擴增條件略有差異,但它們的原理都是相似的。

2.擴增的步驟

(1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA樣品。

(2)用10μl 1×PCR緩衝液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl₂,16mmol/LDTT)。

(3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引子。

(4)反應混合物於93℃變性處理7min。

(5)冷卻至室溫,加入4UTaqDNA聚合酶,反應最終體積為100μl。

(6)加入50μl礦物油,離心10s。

(7)置70℃保溫5min。

(8)PCR擴增25個循環,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最後於70℃延伸10min。

PCR檢測出現假陰性的原因有：標本中的HIV-DNA量極少，未能有效地擴增或擴增產物達不到檢測水平；DNA模板和PCR產物未能完全變性，使得引子不能或較少與DNA片段結合，從而降低了最終產物的產量。如果臨床標本中的HIV基因發生變異，也會出現假陰性。PCR假陽性的原因主要有：標本的交叉污染；重複使用不幹淨的器具。此外還要合理設置對照，陰性對照用無HIV-DNA標本的反應混合液，陽性對照用已知的HIV-DNA。

三、擴增產物的檢測和分析

擴增產物的檢測和分析可採用凝膠電泳，限制性內切酶圖譜，DNA序列分析及分子雜交等技術。

（一）凝膠電泳分析

根據所採用的引子對之間DNA片段的長度，預計PCR產物的分子大小。通過與凝膠電泳後的DNA片段相比較，可初步判斷PCR產物的特異性，然後將產物用限制性內切酶水解，進一步確定擴增產物的特異性。

（二）分子雜交分析

分子雜交既是檢測PCR產物特異性的一種較好的方法，也是檢測擴增產物的非限制性內切酶位點上鹼基突變的有效方法。分子雜交法是根據標記探針與兩條引子鏈之間特異DNA片段的互補性進行的。結果陽性說明PCR產物是特異性的。可利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針與PCR產物進行分子雜交，檢測PCR產物的鹼基突變。現將檢測HIV-DNA的PCR擴增產物常用的幾種分子雜交技術分別介紹如下：

PCR擴增技術和分子雜交的敏感性。

PCR技術檢測HIV具有敏感性高，特異性強的優點。該方法可檢測血液及組織標本中微量的HIV及前病毒序列。如對HIV-1感染H9細胞的擴增產物進行液相雜交和EB染色的電泳凝膠來檢測PCR技術的靈敏性。可檢測到0.05感染細胞的RNA量(相當於5個感染H9細胞的HIV-1-RNA/5×106個未感染細胞)。

四、PCR技術在HIV檢測中的應用

PCR可用來追蹤HIV的自然感染史。可在其它血清學和病毒學標誌出現前檢測病毒序列，這樣可判定無症状而且血清陰性患者潛在的HIV的傳播性；可用來監測長潛伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治療期間病毒的水平；也可用於HIV-1血清陽性母親的嬰兒的HIV檢測。在嬰兒出生後最初的6～9個月期間，他們的血液中存在母體的抗體，因此用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。

（一）血清抗體陽性病人HIV序列的檢測

有人從AIDS或ARC病人的外周血單核細胞培養物，精液細胞和精液上清製備DNA。然後用PCR法和逆轉錄酶測定法分別檢測HIV-1。PCR擴增產物與32P標記的探針退火之後用BstNI消化。再進行聚丙烯醯胺凝膠電泳和自顯影。結果表明，在逆轉錄酶陰性的28個細胞系中有9個以及用逆轉錄酶法不能確定的9個細胞系中有2個為陽性。這說明過去許多細胞培養物認為是陰性者，實際上用更敏感的PCR測定時則為陽性。

從血清陽性的HIV感染者的外周血單核細胞中可檢測出前病毒序列。通過共培養分離出病毒的血清陽性的同性戀男人血液製備的DNA，用PCR可100%檢出病毒序列；用血清陰性共培養陰性同性戀者的標本，經PCR擴增檢出病毒序列者為64%，血清陰性正常人標本PCR檢測也為陰性，表明未出現假陽性結果。由於HIV-1基因組的廣泛的異源性，為提高檢測的陽性率可採用多種引子（如LTR，gag和env基因的引子）。利用PCR法從313份已證實為抗體陽性的標本中檢測出310份HIV陽性（99%）。

(二)血清抗體陰性病人的HIV序列的檢測

由於在感染HIV後到出現免疫反應之前有一段滯後期,這個血清學陰性的滯後期通常長達6周至6個月,而且無抗體產生期可能更長些.在此期間受感染者往往檢測不到抗體,因此,血清陰性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中檢測到HIV-1比由血清學轉陽確診的時間可以提高6個月對少數初次共培養呈陰性的人,甚至可在血清轉陽之前24～39個月就能確診為HIV-1感染.對血清學試驗結果不能確定者,也可通過PCR作進一步分析和確診。

(三)新生兒HIV序列的檢測

HIV感染的母親其嬰兒由於母體抗體的存在,用抗體檢測法通常為陽性.但實際上只有20%～60%的嬰兒受到HIV感染.因此,對這些嬰兒進行HIV感染的早期診斷是十分重要的.現已證明30～50%的這些新生兒可在母親的子宮里,在分娩和引產或通過產後哺乳時從其母體感染HIV.新生兒血清陽性者並不能說明是HIV感染.因為母體HIV抗體可持續大約15個月久.在一般情況下,嬰兒並不表現出HIV感染的任何症状.病毒細胞培養法對嬰兒並不是一種可靠實用的方法;HIV特異IgM抗體的檢測在母體抗體存在下也是不可能的;在過量血清抗體存在下檢出血清中的HIV抗原也是十分困難的.另外,嬰幼兒被HIV感染後病情發展較快.早期診斷,對及時採取治療措施,延緩阻止病情發展極為重要.目前所使用的抗病毒藥毒性大,因而不能用於HIV抗體陽性而未感染的嬰幼兒.但當用PCR檢測出HIV-DNA序列後,即可進行抗病毒治療以及加強免疫機能和營養的治療.在一項研究中,14名血清陽性母親的新生兒用PCR檢測其中6個為陽性;在出生後12～15個月內血清陰性的10個兒童中有5個為PCR陽性.從血清陽性母親出生1個月的新生兒中,收集的外周血單核細胞經PCR檢測,7個為陽性的嬰兒,其中5個在檢測後10個月得AIDS;而PCR陰性的9個嬰兒,在16個月的追蹤檢查期間身體狀況良好.這些研究表明,PCR技術對被HIV感染母親的新生兒和血清陰性兒童進行早期的直接的HIV-1檢測是十分重要的.

PCR技術檢測HIV-DNA序列對AIDS和ARC的確診起著重要作用.但也有人認為對已知HIV抗體、抗原或培養陽性的病人不必再做PCR。最合適的PCR檢測對象是那些疑有HIV感染但又缺乏確切的血清學依據的人群，如上述的HIV陽性母親所生的嬰兒，陽性患者的性伴侶，靜脈吸毒者和可疑的血清反應者。PCR技術還可用來檢測血液製品及疫苗中有無HIV。

五、愛滋病診斷標準：

1．愛滋病病毒抗體陽性，又具有下述任何一項者，可為實驗確診愛滋病病人。

（1）近期內（3-6個月）體重減輕10%以上，且持續發熱達38℃一個月以上；

（2）近期內（3-6個月）體重減輕10%以上，且持續腹瀉（每日達3-5次）一個月以上。

（3）卡氏肺囊蟲肺炎（PCR）

（4）卡波濟肉瘤KS。

（5）明顯的黴菌或其他條件致病感染。

2．若抗體陽性者體重減輕、發熱、腹瀉症状接近上述第1項時，可為實驗確診愛滋病病人。

（1）CD4/CD8（輔助/抑制）淋巴細胞計數比值<1，CD4細胞計數下降；

（2）全身淋巴結腫大；

（3）明顯的中樞神經系統佔位性病變的症状和體征，出現痴呆，辯別能力喪失，或運動神經功能障礙。