細胞免疫檢測法
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細胞免疫檢測法(assays of cellular immunity)，檢測參與免疫應答的各種細胞（即免疫細胞）的數量和功能的方法。免疫細胞包括各類白細胞和它們的前體細胞。血液中的白細胞是成熟的免疫細胞的代表，可按形態分為淋巴細胞、單核細胞（在組織中轉變成巨噬細胞）、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和漿細胞等。基中，淋巴細胞又可藉表面特徵和功能的不同再分為 T細胞、B細胞、K細胞(殺傷細胞)和NK細胞（自然殺傷細胞）等。除血液外，大部分免疫細胞分布於身體各免疫器官中。各類免疫細胞都從骨髓造血幹細胞分化而來，只有 T細胞在胸腺中成熟，其餘細胞都在骨髓中成熟。免疫細胞成熟以後，被分送到血液、脾臟、淋巴結或其他淋巴組織行使功能。正常情況下，各免疫器官所含各類免疫細胞的數量和相互比例有一定的正常值範圍，其分布有一定的解剖學區域，如T細胞分布於脾臟和淋巴結的胸腺依存區、 B細胞分布於脾臟和淋巴結的非胸腺依存區。各類免疫細胞的正常含量與分布是維持免疫系統正常生理功能的基礎。各類免疫細胞能單獨或聯合地對各種外來的、內生的不利於身體的大分子物質或細胞產生適當的反應，將它們解毒、殺死、吞噬、消化，最後清除體外，以維持身體的內環境穩定，便於正常生理活動的進行。由於免疫系統或其他系統的疾病，由於免疫接種或某些臨床治療措施，由於某些外界環境因素的影響，免疫細胞的數量和功能均可發生變化。這些變化又能引起身體其他生理功能的異常，或導致各種新的繼發性病變。因此進行細胞免疫檢測，對於某些疾病的診斷和其發病機理的分析，對某些免疫接種或治療措施的效果評估，對某些環境因素對免疫細胞影響的研究等方面，都具有重要的意義。細胞免疫的檢測方法很多，內容、目的及方法的難易程度有很大的不同，必須根據自己的目的和條件選用適當的方法。常用的細胞免疫檢測方法如下。
免疫細胞的數量檢測
正常情況下，身體各部分各類免疫細胞的含量與分布保持相對穩定。任何疾病或異常原因打亂免疫細胞的新生與破損死亡兩過程的平衡，即可造成這些細胞數量與分布的變化。表1列出不同原因引起的免疫細胞數量變化的發生部位及細胞的特性。
各種原因引起的免疫細胞數量變化表現多數都在血液中有所反映。所以，血液是細胞免疫檢測法最常選用的樣品，只有在必要時，才從骨髓或其他免疫器官取材檢查。
①血液白細胞計數。是醫院最常用的化驗檢查項目之一，實際上就是血液中總的白細胞濃度的測定。成人血中白細胞濃度的正常值為4000～10000個/mm3。新生兒的正常值較成人高，為11000～20000個/mm3。血液白細胞計數是診斷的依據。若白細胞計數異常，則需要作白細胞分類等檢查（見血液常規檢查）。
②血液中白細胞的分類計數。正常人體血液中各類白細胞的數量有一定的比例。表2示其特徵。
在異常或疾病情況下，不管白細胞總數是否發生改變，各類白細胞之間相對數量的百分率都可能發生變化。這些變化是診斷的依據之一。血中白細胞分類計數方法比較簡單，屬於醫院的常規化驗檢查項目。取一滴血，在載玻片上做成塗片，經固定染色，即可在顯微鏡下觀察。數100個細胞，計算每一類白細胞的百分率。
③血中T細胞與B細胞的分類計數。在正常人血中，T細胞與B細胞的數目分別占淋巴細胞總數的65～80％和5～15％。若兩類細胞的百分數發生變化，應根據淋巴細胞總數來判斷這種變化是絕對數還是相對數變化引起的。在進行血中T細胞和B細胞分類計數時，大量紅細胞和粒細胞的存在給檢測帶來很大的不便，所以需要將淋巴細胞從血中分離出來，再根據T細胞和B細胞的表面標記不同，對提純的淋巴細胞作T細胞和B細胞的百分數測定。
不同血細胞的密度有差別，淋巴細胞較輕，比重低於1.077，紅細胞、粒細胞和血小板較重，比重高於1.077。若將加有抗凝劑的血放到比重為 1.077的細胞分離液表面上，將裝液體的試管離心，紅細胞、粒細胞和血小板均沉於細胞分離液之下到達管底，而淋巴細胞和少量單核細胞浮在細胞分離液之上。取出浮在上面的淋巴細胞，即可作T細胞與B細胞百分數的檢測。
人的T細胞表面有綿羊紅細胞(SRBC)的受體，因此可與綿羊紅細胞結合。若將分離提純的淋巴細胞與過量的SRBC混合，經過離心使細胞緊密接觸。在室溫或4℃冰箱放置一段時間後，將細胞重新混懸起來，滴一滴細胞懸液在玻片上做成壓片，在顯微鏡下觀察。淋巴細胞可成為中心包繞三個以上SRBC，形成細胞集團，形如一個花環（圖1）。因紅細胞的英文字(erythrocyte)第一個字母是E，所以稱這種細胞集團為E-花環。E-花環中心的淋巴細胞就是 T細胞，不結成花環的散在淋巴細胞為非 T細胞。將結花環和不結花環的淋巴細胞分別計數，累計100或200個淋巴細胞即可得知淋巴細胞中含T細胞和非T細胞的百分數。
人的T細胞表面有CD3抗原，B細胞表面有表面免疫球蛋白。將分離提純的淋巴細胞用抗CD3的抗體作免疫熒光「染色」可使 T細胞帶上熒光物質；用抗免疫球蛋白的抗體「染色」可以使 B細胞帶上熒光物質。帶上熒光物質的細胞在一定波長的激發光作用下可以產生熒光，用熒光顯微鏡或流式細胞計數器，可鑒別發熒光與不發熒光的細胞，並能分類計數。因此，對提純的淋巴細胞分別用CD3抗體或抗免疫球蛋白的抗體作免疫熒光染色，就可以進行淋巴細胞中含T細胞或B細胞百分數的檢測。這種方法比E-花環形成試驗的結果要準確一些。
人的 T細胞中帶CD4抗原的細胞稱T4細胞，帶CD8抗原的細胞稱T8細胞。T4與T8細胞組成T細胞的兩亞類，分別表現不同的免疫功能。在正常人，T4細胞數多於T8細胞數，兩者的比例約為2:1，在有些疾病中，其比例可發生變化。獲得性免疫缺陷症候群時人免疫缺陷病毒侵犯T4細胞，引起T4細胞減少，可出現T4細胞與T8細胞比例倒置(小於1)的現象。對T4和T8細胞計數的方法，與對T細胞和B細胞的計數方法相似，可用抗CD4的抗體或抗CD8的抗體，分別對提純的淋巴細胞或T細胞進行免疫熒光染色，再用熒光顯微鏡或流式細胞計數器計數。
免疫細胞的功能檢測
在自然條件下，免疫細胞的功能都是在體內完成的。但在進行免疫細胞功能檢查時，主要採用體外實驗的方法。其基本過程是，從待檢查者分離欲檢測的細胞，用適當的刺激物或單純的營養液與細胞一起培養，觀測細胞發生的與體內功能有關的反應性變化。根據所用刺激物的性質不同，可將試驗分為特異性反應功能和非特異反應功能檢測兩類。
①淋巴細胞轉化試驗。是淋巴細胞功能檢測最基本的方法。淋巴細胞平常在未受到刺激時，處於相對的代謝靜止狀態。在體外培養的淋巴細胞受到某些刺激物的作用後，經過3～5天，可發生形態學的變化，胞漿增多，胞核擴大，繼而出現有絲分裂。這些變化稱為淋巴母細胞樣轉化現象或淋巴細胞增殖反應。在淋巴細胞發生母細胞樣轉化的過程中，細胞的蛋白質、RNA和DNA的合成都增加，出現代謝活化現象。因此，在進行淋巴細胞轉化試驗時，可用形態學的方法或生物化學的方法來檢測試驗結果。淋巴細胞轉化試驗可根據所用刺激物的不同分為三種。一為促有絲分裂素引起的淋巴細胞轉化反應。促有絲分裂素為一些來自植物或微生物的糖蛋白或多糖物質，能非特異地作用於正常人的淋巴細胞，引起淋巴細胞轉化反應。適用於人的淋巴細胞轉化試驗的促有絲分裂素有五種，即植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、美洲商陸 (PWM)、金黃色葡萄球菌CowanⅠ株(SAC)、乙型副傷寒桿菌 (SPB)。它們引起T細胞和B細胞轉化的能力有不同。檢測之前，各實驗室需測定正常人 T細胞和B細胞轉化反應的均值與正常範圍，作為比較的標準。
特異性抗原引起的淋巴細胞轉化反應。在正常人體內能與某一種特異抗原結合的淋巴細胞在全體淋巴細胞中只佔很小的比例，約為幾十萬分之一。所以正常人的淋巴細胞幾乎不能對抗原發生可測的轉化反應。人體接受某種抗原的刺激後，能與相應抗原結合的淋巴細胞在體內發生活化和增殖，轉變為數量較多對抗原反應明顯的致敏淋巴細胞。因此，受過抗原刺激的人，其淋巴細胞含有較多的致敏淋巴細胞，在體外與特導抗原一起培養便可發生淋巴細胞轉化反應。抗原引起的淋巴細胞轉化試驗，在於檢測人體是否已經接受過某種抗原的刺激。
混合淋巴細胞培養 (MLC)反應。是將組織相容性抗原（ HLA抗原）不同的兩個人的淋巴細胞放在一起培養時，發生的淋巴細胞轉化現象。在MLC反應中，T細胞是反應細胞，HLA抗原不同的異體B細胞是刺激細胞。如果二人的HLA抗原完全相同，則不會發生MLC反應，或者稱為MLC反應陰性。在某些疾病時，T細胞的免疫功能下降，病人對HLA抗原不同的人淋巴細胞發生MLC反應的能力也減弱。
②淋巴因子產生試驗。淋巴細胞在受到各種刺激後發生代謝的活化，同時可產生並釋放多種有生物學活性的物質，稱為淋巴因子。因此，淋巴因子產生試驗與淋巴細胞轉化試驗具有相似的意義，用來檢測淋巴細胞對不同刺激物的反應能力。較常用的淋巴因子產生試驗是白細胞移動抑制因子（或巨噬細胞移動抑制因子）產生試驗。白細胞移動抑制因子和巨噬細胞移動抑制因子分別能抑制裝在毛細玻璃管中的白細胞或巨噬細胞向管口外移動。在作白細胞（或巨噬細胞）移動抑制因子產生試驗時，一般是用特異性抗原作刺激物，若淋巴細胞能發生反應釋放白細胞移動抑制因子或巨噬細胞移動因子，說明此人已接受過該抗原的刺激，對該抗原可表現特異的細胞免疫反應。此試驗的結果，往往與身體對同一抗原的遲髮型過敏皮膚試驗的結果一致。
③細胞介導的細胞毒試驗。一種細胞通過直接接觸將另一種細胞殺傷的現象，稱為細胞介導的細胞毒作用。前種細胞為殺傷細胞，後種細胞為靶細胞。在人體內有兩種能直接殺傷靶細胞的細胞，即自然殺傷細胞（NK細胞）和特異性殺傷 T細胞（特異性Tc細胞）。NK細胞可存在於未受抗原刺激的正常人體，對某些受感染的細胞、腫瘤細胞或正常的未成熟造血細胞有殺傷活性。特異性Tc細胞存在於受過特異抗原刺激的人體內，能殺傷帶特異抗原的受感染細胞、異體細胞、自身組織細胞或腫瘤細胞。這兩種殺傷細胞借不同的機制在抗感染免疫、抗腫瘤免疫、自身免疫病及移植免疫的過程中均有重要意義。兩種殺傷細胞在體外的功能檢測，只是所用的靶細胞各不相同，檢測的方法都是相同的，常用放射性核素51銘（51Cr）釋放法。此方法的原理是，將靶細胞預先用51Cr標記，51Cr能與胞漿中的蛋白質結合。靶細胞標記的51Cr量可用γ射線計數器測量其cpm值來表示。靶細胞與殺傷細胞混合後經過離心，使兩種細胞壓緊，密切相互作用。培養一段時間後，被殺傷靶細胞內的51Cr會釋放到胞外來，可以測量細胞培養液中游離51Cr的 cpm值，以表示靶細胞受破壞的程度(圖2)。因此，可用培養後所測培養液中的cpm值與靶細胞標記的總 51Cr量的 cpm值之比表示殺傷細胞對靶細胞的殺傷率(又稱 51Cr的特異釋放率)。靶細胞的51Cr特異釋放率即被殺傷百分率，與殺傷細胞的數量與殺傷速度成正相關，所以可用此測量結果作為殺傷細胞功能強弱的指標。
④抗體分泌細胞的檢測。分泌抗體的漿細胞由 B細胞分化而來，但在此分化過程中，往往需要T細胞與單核—巨噬細胞協作。因此對抗體分泌細胞的檢測，實際上是對B細胞、T細胞和巨噬細胞功能的綜合性評價。抗體分泌細胞的檢測，依抗體的特異性不同，可分為針對某種抗原的特異抗體分泌細胞的檢測，以及無一定特異性的免疫球蛋白分泌細胞的檢測。抗體分泌細胞的檢測還可因其產生的條件不同而分為三種方法，其結果表示的意義也有差別。在自然條件下人體內存在的免疫球蛋白(Ig)分泌細胞，稱為自發性Ig分泌細胞。它們反映人體在自然情況下受抗原刺激的情況，並且與年齡的增長有關。受抗原注射後，在體內產生的特異抗體的分泌細胞，能反映人體的體液免疫應答功能。但是，對人無益的抗原不能輕易給人注射，此方法多用於動物試驗。取人的淋巴細胞，在體外培養，經過各種刺激，能夠引起非特異性Ig分泌細胞的產生，稱為體外的抗體產生免疫應答。此體外試驗對於分析T細胞、B細胞和巨噬細胞在抗體產生反應中的功能作用很有意義。抗體分泌細胞的具體檢測常用溶血空斑技術，即將待檢細胞與經過處理的綿羊紅細胞混合，再加入補體及顯斑劑，灌入用兩張玻璃片做成的窄縫狀小室內。經過37℃培養一段時間，抗體分泌細胞周圍的綿羊紅細胞被溶解，形成一個圓形的透明區，稱為溶血空斑。空斑中心的抗體分泌細胞又稱為空斑形成細胞(PFC)。所以抗體分泌細胞的檢測也稱PFC的檢測。
⑤嗜中性粒細胞吞噬功能的檢測。血液白細胞中佔比例最大的就是嗜中性粒細胞，能作較快的變形運動，有對異物的吞噬作用。對嗜中性粒細胞吞噬功能的檢測常用形態學檢查方法。將抗凝的血1～2ml經過離心沉澱，取出壓積細胞表面的白細胞層(可混入一些紅細胞)，將此細胞與一定數量的細菌懸液混合，於37℃培養一段時間。用低速離心方法洗去白細胞外的細菌，將白細胞作塗片染色，於顯微鏡下觀察。順序觀察100～200個嗜中性粒細胞，並記下吞噬細菌的細胞數及被吞噬的細菌數。100 個嗜中性粒細胞中吞噬細菌的細胞數稱為吞噬百分率。在100個白細胞中，平均每個細胞吞噬的細菌數稱為吞噬指數。在對人或動物作嗜中性粒細胞吞噬功能檢測時，常需要同時計算出吞噬百分率和吞噬指數以綜合評價其吞噬功能。
⑥嗜中性粒細胞 NBT還原試驗。嗜中性粒細胞在吞噬細菌或異物後，還需要消化分解異物。這種能力與葡萄糖在細胞內的氧化分解有關，在葡萄糖氧化脫氫的過程中，可以產生硝基藍四氮唑(NBT)還原的反應。正常人的嗜中性粒細胞在吞噬異物後，可發生與消化異物相關的糖氧化分解反應，若在體外遇到NBT，即可使NBT由黃色變成藍色的顆粒沉積於胞漿內。慢性肉芽腫的患者，其吞噬細胞的吞噬作用表現正常，但對吞噬的異物缺乏消化分解的能力。用這些人的嗜中性粒細胞做 NBT還原試驗，呈現陰性反應，即胞漿中不出現藍色顆粒，或只有很少的藍色顆粒。此外，在細菌感染時，NBT還原試驗呈陽性的吞噬細胞增加。
⑦巨噬細胞吞噬功能的測定。巨噬細胞是重要的免疫細胞，具有處理與傳遞抗原、產生白細胞介素1和其他細胞因子，以及吞噬異物或異常細胞的功能。巨噬細胞功能的檢查在動物進行的研究較多，在人的研究較少，因為從人體獲得巨噬細胞困難。中國張友會等人利用含有斑蝥浸出液的濾紙片貼於人的皮膚，引起皮皰，從皮皰液中可得到較多的巨噬細胞，這為進行人的巨噬細胞的研究提供了方便。巨噬細胞的體積大、吞噬力強，可用羊或雞的紅細胞作為吞噬作用的指標，檢測巨噬細胞的吞噬功能。這比用細菌作吞噬的指標較易觀察結果。
細胞免疫功能體內測定技術
如延緩型皮膚變態反應，又稱（遲髮型超過敏反應）包括結核菌素試驗、二硝基氯苯(DNCB)或二硝基氟苯(DNFB)皮膚試驗。結核菌素試驗是以不同類型的結核菌素和不同方法進行的皮膚試驗，用以診斷結核病及細胞免疫缺陷病的參考。試驗用舊結核菌素(OT)或純蛋白衍化物(PPD)，多用將試劑體內注射的芒圖氏法。隔一段時間視局部有無紅暈、硬結，觀察人體對結核菌素有無延緩型變態反應（Ⅳ型）。陽性者表示過去或現在接觸過結核桿菌，但不一定有活動性結核；陰性表示無結核感染，結核感染早期或病情危重、營養極度不良、某些急性傳染病（如麻疹）、惡性腫瘤時均可表現陰性。給小兒接種卡介苗前應先做結核菌素試驗，陰性者方可接種。
二硝基氯苯和二硝基氟苯以致敏劑量塗於前臂，48～72小時後局部可見紅暈、硬結乃至大皰、潰瘍，表現似結核菌素試驗，這也是延緩型變態反應。正常人多呈陽性，但細胞免疫缺陷者反應減低或為陰性。此法用於測定腫瘤患者的細胞免疫功能。但因該試劑副作用大，現已很少用。
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