臨床生物化學/免疫方法測酶質量的臨床應用

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臨床生物化學

診斷酶學
- 診斷酶學概述
  - 血清酶的分類
  - 血清酶變化的病理生理機制
  - 血清酶的生理變異
  - 測定方法、標本處理等對測定結果的影響
  - 免疫方法測酶質量的臨床應用

用免疫學方法測酶質量和經典的測酶活性方法相比，不僅靈敏度高，並可能測定一些以前不易測定的酶。但更為有意義的是：有可能為臨床上的應用提供新的資料和信息。從疾病論斷的角度來看，至少提供下列三個的可能性：

（一）酶活性和酶質量變化的不平行

這二者的變化在不少情況下是互相平行的，但在一些情況下可以出現不一致。早在1987年Robert就提出可以用免疫學方法直接測量CK的質量，並聲稱：「由於RIA法是如此的敏感，並可測定血循環中無活性的CK-MB，毫不奇怪此法可比其它方法更早查出心肌梗死，一般在疼痛3小時就可升高。」此後有些學者在急性心肌梗死時比較測CK-MB活性和RIA法CK-B亞單位的結果，發現二者之間存在著不平行關係。CK-MB活性升高持續較短，3天左右；而CK-B亞單位酶蛋白升高卻在7天左右。近幾年來發展了用免疫學方法測CK-MB酶質量（mass）方法與測酶活性（activity）方法的結果相比較，在檢測心肌壞死上，測質量方法明顯優於測活性方法。

國內有人報告了用單擴法測酶活性的方法，測定了在各種患者血中超氧歧化酶（SOD）含量，證實有些患者血中存在著無活性的SOD。

在一些疾病情況下，甚至出現二者變化完全相反的情況。例如在狗實驗性胰腺炎，用免疫學方法測彈性蛋白酶濃度，出現迅速而急劇地上升，但同時酶活性卻出現平行地下降。作者解釋在釋放酶蛋白入血同時，有大量酶抑制劑也釋放入血，以致出現相互矛盾結果。前面提到的用兩種方法測前列腺酸性磷酸酶（PACP）來診斷前列腺癌的陽性率不一致，有作者也認為可能是腫瘤組織合成一些無活性或活性較低的酸性磷酸酶。

如果說在這方面尚有爭論，那麼在遺傳學方面的意義則是比較明確的，將此兩大類方法結合起來可以研究酶缺陷遺傳疾病的發生機制，用免疫學方法可以測出滅活的酶蛋白量。由於基因缺陷引起的酶缺陷如果僅僅影響酶蛋白合成下降，酶活性與酶蛋白量的比率即所謂的「免疫比活性」無變化；如果由於基因缺陷合成了變異的酶蛋白，則不僅總酶活性下降，免疫比活性也將變化；如果合成了一種活性正常但結構不穩定的酶，則幼稚細胞中酶活性及質量都無變化，而在衰老細胞中將出現酶缺陷。酶穩定性的變異常見於紅細胞內酶缺陷症。這是由於紅細胞壽命較長，成熟紅細胞無細胞核不能製造新蛋白質，所以酶穩定性的缺陷容易在衰老紅細胞中表現出來。

在最嚴重的情況，變異的基因甚至能合成無活性的酶蛋白，如膽鹼酯酶遺傳變異中，有一類型所謂「不活動等位基因」（「silent」allele）就是典型例子。又如在Lesch-Nyhau症候群中存在這免疫活性但無催化活性的次黃嘌呤轉磷酸核糖基酶。

（二）以免疫方法取代測酶活性方法

免疫學方法和經典測酶活性方法相比最突出的優點是：免疫學方法能測定一些不表現酶活性的酶蛋白質，這在以前是不能想像的。首先是各種酶原，還有去輔基酶蛋白（apoenzyme）以及一些滅活的酶蛋白裂解產物等等。例如已有用RIA法測胰蛋白酶原。也有用免疫學方法測定粒線體和胞質穀草轉氨酶，這其中包括無酶活性的去輔基穀草轉氨酶。

免疫學方法另一特點是特異性高，且不受體液中其它物質，特別是抑制劑、激活劑的干擾。不少蛋白水解酶或者對基質特異性不高，或者易受血中一些蛋白質如α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白的抑制作用。用測酶活性方法不易準確定量甚至無法測定。在近年來用免疫學方法陸續建立了RIA測胰蛋白酶、彈性蛋白酶的方法。

一般說來和測酶活性相比，免疫學方法靈敏度更高一些。一些既往由於方法學靈敏度差，不易測定的酶可以嘗試改用免疫學方法，脂肪酶是其中例子之一。經典測酶活性方法由於靈敏度差，酶溫育時間長達24小時，幾經修改仍需4小時，現已有RIA法脂肪酶試劑盒。近年來隨著優生學發展，羊水中各種成分包括酶的測定日益受到重視。例如在Tay-Sachs症候群時，胚胎組織細胞中氨基已糖苷同工酶A或（和）B合成障礙，免疫學方法由於靈敏度高，可以比測酶活性方法早幾周在胎兒的羊水中查出此酶的缺陷。

（三）同工酶測定

免疫學方法用於測定同工酶比經典的理化方法簡單方便，所以愈來愈多同工酶測定改用免疫學方法，國外已逐步取代電泳或層析法。除上文已提到的CK-MB、LD₁、LD₅測定外，還可用免疫學方法測半乳糖醯基轉移酶同工酶A和B，鹼性磷酸酶的Regan同工酶。同工酶有可能作為腫瘤的標記物（tumor marker），已證實γγ-烯醇化酶或神經元特異烯醇化酶（NSE）可作為APUD系統腫瘤的一個很好標記物。用RIA測血中NSE在肺小細胞性腫瘤患者中陽性率超過80％，γγ-烯醇化酶在大細胞肺癌陽性率也超過70％。可以預期隨科學技術發展，免疫學方法將成為臨床上測定同工酶的主要方法。

六、檢測同工酶及其亞型的臨床意義

從50年代中期開始，臨床酶學有了迅速的發展，幾乎把當時能測的酶都在臨床上試用過，企圖通過測定某一種或某幾種酶來診斷一些特定疾病或特定組織器官的病變。通過10餘年廣泛的研究，發現酶測定診斷疾病的特異性並不高，因為機體中各種細胞的代謝有很大的相似性，從臨床角度很難說存在著所謂器官特異酶。當時曾有學者想找出一些腫瘤特異酶，但很快發現找不到一種只存在於腫瘤組織並能進入血液而正常組織又不存在的酶。

在此同時，Market等通過對LD在電泳時可分為5個區帶的深入研究，在1959年首先提出「isozyme」的術語來描述一類酶，它們催化同一生化反應，但在結構和理化性質上有所不同，目前廣泛使用國際生化協會推薦術語「isoenzyme」。我國目前多翻譯為同工酶，臨床很快將此新概念、新發現用於臨床，發現同工酶測定可以彌補上述測酶總活性的不足之處，因為不同同工酶在組織分布、細胞內定位、發生髮育方面都可能有所差異，臨床可利用這些差異來增加診斷的特異性。目前不論在診斷腫瘤，還是診斷心臟、肝等疾病上都找到一些較總酶活性測定特異性、靈敏度高的同工酶測定項目，同工酶正逐步成為酶學中一個重要分支。

80年代發現某些同工酶從組織進入體液後，進一步變化分為數個不同類型即所謂同工酶的亞型（isoform）。CK-MB的亞型MB₁、MB₂，CK-MM亞型MM₁、MM₂和MM₃在AMI的診斷和溶栓療效判斷上都優於總酶和同工酶。

同工酶是一個複雜的生物現象，至今在分類、概念上尚有一些問題有待研究澄清。從臨床診斷角度可將同工酶理解為一個包括有多種能催化相同生化反應的酶族，在這族中雖然不同酶都催化同一反應，但在理化性質上有差異，如它們對底物的親和性、特異性不同，對抑制劑出現不同的反應，所帶電荷、對熱耐受性有差異等等。生化學者根據這些差異用各種物理、化學方法將同工酶分離測定，從本質上說這些差異與酶蛋白結構有關，或者是構成酶蛋白的胺基酸在組成或排列次序上出現差異，或者由於二級、三級乃至四級結構不同而造成上述不同的理化性質，同時這些結構差異又可引起酶蛋白抗原性的差異。目前正在大力發展這種用免疫方法測同工酶的技術，並取得明顯進展。

同工酶之所以有較高的診斷價值與下面一些因素有關：

首先是某些同工酶有明顯的組織分布差異，以目前臨床應用最多的CK和LD同工酶而言，CK大量存在於三種肌肉組織中，單獨總CK升高很難判斷。CK升高的組織來源為：骨骼肌中主要為CK-MM，平滑肌中為CK-BB，心肌中雖然大多數仍是CK-MM，但卻含有14％-40％的其它兩種肌組織中沒有或僅含少量的CK-MB，這樣只要能測CK同工酶，根據同工酶變化，不難判斷出釋放CK的器官或組織。

LD雖然幾乎存在於全身各種細胞中，但其五種同工酶在體內分布情況並不相同。如LD₁主要存在於心肌和紅細胞中，LD₅則主要存在於肝臟和骨骼肌中，正常血清中同工酶分布為LD₂＞LD₁＞LD₃＞LD₄＞LD₅，這樣雖然心臟和肝的多種疾病都能引起總LD升高，但對血清LD同工酶影響卻大不相同。如AMI時，LD₁明顯增高以致LD₁＞LD₂，肝病時將出現LD₅＞LD₄，AMI患者在LD₁＞LD₂基礎上，又同時出現LD₅＞LD₄，可懷疑是否有右心衰竭，引起肝淤血。有些酶的同工酶與上述情況不同，只是細胞內定位不同，臨床上有診斷意義的主要是粒線體同工酶，粒線體中有一些酶在結構和性質上往往與細胞質中同工酶有明顯差異，臨床應用較多的是粒線體AST。輕度病變時，由於粒線體有兩層緻密的膜，此同工酶很難進入血清，但在細胞壞死病變時，血清中粒線體同工酶常明顯升高。近年來發現ALT也存在著兩種同工酶，肝臟疾病時ALT經常升高，ALT同工酶測定應該對肝病預後判斷有一定價值。

在胚胎期，和器官的發生髮育一樣，這一時期酶帶有早期種族進化的痕迹，與出生後人體的酶往往有差異。當人得腫瘤後，腫瘤細胞可以出現返祖現象，有可能出現胚胎期同工酶，測定這類同工酶有助於診斷腫瘤，例如胚胎期CK主要為CK-BB，約有10％惡性腫瘤患者血清可查出CK-BB，又如一些腫瘤患者血中可查到胎盤性ALP等等。

總之，隨著科學技術的發展，測定項目的增加，測定方法的簡化，同工酶測定將在診斷疾病、判斷療效和預後方面起著愈來愈大的作用。