生物化學與分子生物學/DNA的二級結構與功能

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生物化學與分子生物學

核酸的結構與功能
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(一)DNA的二級結構雙螺旋結構模型(double helixmodel)

1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA分子的雙螺旋結構模型，揭示了遺傳信息是如何儲存在DNA分子中，以及遺傳性狀何以在世代間得以保持。這是生物學發展的重大里程碑。

在DNA雙螺旋結構模型建立之前，早在1868年，Miescher已經從膿細胞提取到核酸與蛋白質的複合物，當時稱為核素(nuclein)。但核酸在生命活動中的重要地位，卻遲至本世紀50年代才被認識。

本世紀20年代，Levene研究了核酸的化學結構並提出四核苷酸假說；40年代末，Avery,Hershey和Chase的實驗嚴密地證實了DNA就是遺傳物質；50年代初，Chargaff應用紫外分光光度法結合紙層析等簡單技術，對多種生物DNA作鹼基定量分析，發現DNA鹼基組成有如下規律(表15－3)。

表15-3　不同生物來源的DNA四種鹼基比例關係

DNA來源	腺嘌呤（A）	胸腺嘧啶（T）	鳥嘌呤（G）	胞嘧啶（C）	（A+T）/（G+C）
大腸桿菌	25.4	24.8	24.1	25.7	1.01
小麥	26.8	28.0	23.2	22.7	1.21
鼠	29.7	25.6	21.9	22.8	1.21
豬：肝	29.4	29.7	20.5	20.5	1.43
胸腺	30.0	28.9	20.4	20.7
脾	29.6	29.2	20.4	20.8
酵母	31.3	32.9	18.7	17.5	1.079

(1)同一生物的不同組織的DNA鹼基組成相同；

(2)一種生物DNA鹼基組成不隨生物體的年齡、營養狀態或者環境變化而改變；

(3)幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同(A］=［T)，鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同(G］=［C)，總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾含量相同(［A＋G］=［C］＋［T)。

(4)不同生物來源的DNA鹼基組成不同，表現在A＋T/G+C比值的不同；

這些結果後來為DNA的雙螺旋結構模型提供了一個有力的佐證。

Watson和Crick以立體化學原理為準則，對Wilkins和Franklin的DNa X射線衍射分析結果加以研究，提出了DNA結構的雙螺旋模式，其主要內容如下：

DNA的雙螺旋結構模式

圖15－5　DNA的雙螺旋結構模式

A.正面觀：長方框內有詳細說明，S代表脫氧核糖。

B.俯視：塗黑的是鹼基，此處全部鹼基都是嘧啶，只看到糖的側面略呈三角形，最外圍是磷酸及其酯鍵。

(1)在DNA分子中，兩股DNA鏈圍繞一假想的共同軸心形成一右手螺旋結構，雙螺旋的螺距為3.4nm，直徑為2.0nm。(圖15－5,A，B)。

(2)鏈的骨架(backbone)由交替出現的、親水的脫氧核糖基和磷酸基構成，位於雙螺旋的外側。

(3)鹼基位於雙螺旋的內側，兩股鏈中的嘌呤和嘧啶鹼基以其疏水的、近於平面的環形結構彼此密切相近，平面與雙螺旋的長軸相垂直。一股鏈中的嘌呤鹼基與另一股鏈中位於同一平面的嘧啶鹼基之間以氫鏈相連，稱為鹼基互補配對或鹼基配對(base pairing)，鹼基對層間的距離為0.34nm。鹼基互補配對總是出現於腺嘌呤與胸腺嘧啶之間(A=T)，形成兩個氫鍵；或者出現於鳥嘌呤與胞嘧啶之間(G=C)，形成三個氫鍵。(圖15－6)。

A－T，G-C間的氫鍵形成

圖15－6　A－T，G-C間的氫鍵形成

(4)DNA雙螺旋中的兩股鏈走向是反平行的，一股鏈是5′→3′走向，另一股鏈是3′→5′走向。兩股鏈之間在空間上形成一條大溝(major groove)和一條小溝(minor groove)，這是蛋白質識別DNA的鹼基序列，與其發生相互作用的基礎。

DNA雙螺旋的穩定由互補鹼基對之間的氫鍵和鹼基對層間的堆積力(basestacking force)維繫。DNA雙螺旋中兩股鏈中鹼基互補的特點，邏輯地預示了DNA複製過程是先將DNA分子中的兩股鏈分離開，然後以每一股鏈為模板(親本)，通過鹼基互補原則合成相應的互補鏈(複本)，形成兩個完全相同的DNA分子。因為複製得到的每對鏈中只有一條是親鏈，即保留了一半親鏈，將這種複製方式稱為DNA的半保留複製(semiconservativereplication)。後來證明，半保留複製是生物體遺傳信息傳遞的最基本方式。

DNA雙螺旋是核酸二級結構的重要形式。雙螺旋結構理論支配了近代核酸結構功能的研究和發展，是生命科學發展史上的傑出貢獻。

(二)DNA結構的多態性

Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構屬於B型雙螺旋，它是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92%相對濕度下進行X－射線衍射圖譜為依據進行推測的，這是DNA分子在水性環境和生理條件下最穩定的結構。然而以後的研究表明DNA的結構是動態的。在以鉀或絕作反離子，相對濕度為75%時，DNA分子的X－射線衍射圖給出的是A構象，A－DNA每螺旋含11個鹼基對，而且變成A－DNA後，大溝變窄、變深，小溝變寬、變淺。由於大溝、小溝是DNA行使功能時蛋白質的識別位點，所以由B-DNA變為A－DNA後，蛋白質對DNA分子的識別也發生了相應變化。

一般說來，A－T豐富的DNA片段常呈B-DNA。採用乙醇沉澱法純化DNA時，整個過程中，大部分DNA由B-DNA經過C－DNA，最終變構為A－DNA。若DNA雙鏈中一條鏈被相應的RNA鏈所替換，會變構成A－DNA。當DNA處於轉錄狀態時，DNA模板鏈與由它轉錄所得的RNA鏈間形成的雙鏈就是A－DNA。由此可見A－DNA構象對基因表達有重要意義。此外，B-DNA雙鏈都被RNA鏈所取代而得到由兩條RNA鏈組成的雙螺旋結構也是A－DNA。除A－DNA、B-DNA螺旋外，還存在B′－DNA、C－DNA、D-DNA等，其結構參數見表15－4。

表15-4　不同右手雙螺旋DNA的結構參數

雙螺旋	鹼基傾	鹼基夾	鹼基間距	螺距	每輪鹼	小溝寬／nm×	大溝寬nm×
	角／（°）	角（°）	/nm	／nm	基數	小溝寬nm	大溝寬nm
B-DNA	0	36.0	0.337	3.4	10	0.57×0.75	1.17×0.85
C-DNA	6	38.0	0.331	3.1	9.3	0.48×0.79	1.05×0.75
D-DNA		45.0	0.303			0.13×0.67	0.89×0.58
A-DAN	20	32.7	0.256	2.8	11	1.10×0.28	0.27×1.35

總之，DNA的雙螺旋結構永遠處於動態平衡中，DNA分子構象的變化與糖基和鹼基之間空間相對位置有關。

1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X-射線衍射圖譜時出人意料地發現這種六聚體的構象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，與右手螺旋的不同是螺距延長(4.5nm左右)，直徑變窄(1.8nm)，每個螺旋含12個鹼基對，分子長鏈中磷原子不是平滑延伸而是鋸齒形排列，有如「之」字形一樣，因此叫它Z構象(英文字Zigzag的第一個字母)。還有，這一構象中的重複單位是二核苷酸而不是單核苷酸；而且ZDNA只有一個螺旋溝，它相當於B構象中的小溝，它狹而深，大溝則不復存在(圖15-7)。進一步的分析還證明，Z－DNA的形成是DNA單鏈上出現嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。

Z－DNA和B-DNA

圖15－7　Z－DNA和B-DNA

Z－DNA有什麼生物學意義呢?應當指出Z－DNA的形成通常在熱力學上是不利的。因為Z－DNA中帶負電荷的磷酸根距離太近了，這會產生靜電排斥。但是，DNA鏈的局部不穩定區的存在就成為潛在的解鏈位點。DNA解螺旋卻是DNA複製和轉錄等過程中必要的環節，因此認為這一結構與基因調節有關。比如SV40增強子區中就有此結構，又如鼠類微小病毒DNS複製區起始點附近有GC交替排列序列。此外，DNA螺旋上溝的特徵在其信息表達過程中起關鍵作用。調控蛋白都是通過其分子上特定的胺基酸側鏈與DNA雙螺旋溝中的鹼基對一側的氫原子供體或受體相互作用，形成氫鍵從而識別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調控蛋白質對DNA信息的識別。ZDNA中大溝消失，小溝狹而深，使調控蛋白識別方式也發生變化。這些都暗示ZDNA的存在不僅僅是由於DNA中出現嘌呤一啶嘧交替排列之結果，也一定是在漫漫的進化長河中對DNA序列與結構不斷調整與篩選的結果，有其內在而深刻的含意，只是人們還未充分認識而已。

DNA構象的可變性，或者說DNA二級結構的多態性的發現拓寬了人們的視野。原來，生物體中最為穩定的遺傳物質也可以採用不同的姿態來實現其豐富多採的生物學功能。

多年來，DNA結構的研究手段主要是X射線衍射技術，其結果是通過間接觀測多個DNA分子有關結構參數的平均值而獲得的。同時，這項技術的樣品分析條件使被測DNA分子與天然狀態相差甚遠。因此，在反映DNA結構真實性方面這種方法存在著缺陷。1989年，應用掃描隧道顯微鏡(scanning tummelingmicroscopy,STM)研究DNA結構克服了上述技術的缺陷。這種先進的顯微技術，不僅可將被測物放大500萬倍，且能直接觀測接近天然條件下單個DNA分子的結構細節。STM技術的應用是DNA結構研究中的重要進展，可望在探索DNA結構的某些未知點上展示巨大潛力。

(三)DNA結構的不均一性(heterogeneity)

在DNA的一級結構中，四種鹼基A，T，C，G遠非均勻分布，儘管雙螺旋的構型大體相同，但沿著DNA鏈各處的物理結構不完全相同，各處雙螺旋的穩定性也就顯示出差別，充分體現了DNA一級結構決定高級結構的原理。其不均一性主要有：

1.反向重複序列(inverted repeats)

又稱迴文序列(palindrome)，它能在DNA或RNA中形成髮夾結構。這種迴文結構通常是作為一種特別信號，如限制性核酸內切酸(restriction encl閂迥onuclease)及調節蛋白的識別位點，轉錄終止信號等。

2.富含A/T的序列

在高等生物中，A+T與G+C的含量差不多相等，然而在它們的染色體某一區域，A.T含量可能相當高。如在很多有重要調節功能的DNA區段都富含A.T，特別是在複製起點和啟動子的Pribnow框(真核生物為TATA框)的序列中，其對於複製和起始十分重要。因為A－T對只有二條氫鍵，此處的雙鏈較G-C對處易於解開，有利於起始複合物的形成。

3.嘌呤和嘧啶的排列順序對雙螺旋結構穩定性的影響。

人們考察了十種相鄰的二核苷酸對(nearestneighbor doublets)，發現一個非常有趣的現象，那就是鹼基組成相同，但嘌呤和嘧啶的排列順序不同，雙螺旋的穩定性具有顯著的差異。例如5′Gc3′　3′G 5′和5′GC 3′　3′GC 5′的穩定性相差很大，前者的穩定性遠大於後。它們的氫鍵數目是相同的，它們的差別在於相鄰鹼基之間的堆集力不同。即從嘌呤到嘧啶的方向的鹼基堆集作用顯著地大於同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的鹼基堆集作用。(這裡的方向就是常規的從5′端到3′端的方向)。這是因為前者的嘌呤環和嘧啶環重迭面積大於後者的嘧啶環和嘌呤環的重迭面積，這在B型DNA中確是如此。

根據Gotoh 1981年的研究，十種相鄰二核苷酸對的Tm值如表15?所示，單位為℃，所用離子強度為19.5mmol/l Na＋。

表15－5　相鄰二核苷酸對Tm值

		3′
		A	T	G	C
5′	A	54.50	57.02	58.42	97.73
	T	36.73	54.50	54.71	86.44
	G	86.44	97.73	85.97	136.12
	C	54.71	58.42	72.55	85.97

由表15-5可以看到，5′TA 3′ 3′AT5′的Tm值最低。在真核生物中，常可以在19到27的位置上看到一個叫做TATA框的結構(又稱Hogness框)，這是RNA聚合酶的結合位點。在這裡RNA聚合酶和有關蛋白質因子形成轉錄起始複合物。

又如，生命有機體選擇UAA作為最有效的終止密碼子絕不是偶然的，因為64個聯體密碼子中，它與反密碼子(假定有的話)形成的互補產物5′UAA3′3′AUU5′的Tm值是最低的一個，即使在生理溫度下也是不穩定的。當初有人花了很多工夫去尋找一個不攜帶胺基酸的專供肽鏈終止用的tRNA，其實並不存在這種tRNA。肽鏈的釋放是由釋放因子 RF在起作用。在三種終止密碼子中，UAG和UGA常會為突變型的tRNA無義抑制，而UAA則很少發生無義抑制也可能就是這個道理。這也就說明了為什麼在肽鏈終止處常常會出現雙重終止密碼子。

(四)DNA的變性、復性與分子雜交

DNA雙螺旋結構模型，不僅與其生物功能有密切關係，還能解釋DNA的重要特性棗變性與復性，這對於深入了解DNA分子結構與功能的關係又有重要意義。

1.DNA變性(denaturation)

指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，鹼基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醯胺等，均可引起核酸分子變性。變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變：

溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構，變性後代之以柔軟而鬆散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。

溶液旋光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變，使DNA溶液的旋光性發生變化。

核酸的解鏈曲線

15－8　核酸的解鏈曲線

增色效應(hyperchromiceffect)。指變性後DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子中鹼基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中鹼基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，於是鹼基外露，鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收，故而產生增色效應。

對雙鏈DNA進行加熱變性，當溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨後即使溫度繼續升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型(圖158)。可見DNA變性是在一個很窄的溫度範圍內發生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由於這一現象和結晶的融解相類似，又稱融解溫度(Tm,meltingtemperature)。在Tm時，核酸分子內50%的雙螺旋結構被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G+C所佔總鹼基數的百分比成正相關，兩者的關係可表示為：

Tm=69.3＋0.41(%G+C)

一定條件下(相對較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長度有關，核酸分子越長，Tm值越大；另外，溶液的離子強度較低時，Tm值較低，融點範圍也較寬，反之亦然，因此DNA製劑不應保存在離子強度過低的溶液中。

2.DNA復性(renaturation)

指變性DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象，它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響：

溫度和時間。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。

DNA濃度。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合的機會越大。

DNA順序的複雜性。簡單順序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時，互補鹼基的配對較易實現。而順序複雜的序列要實現互補，則困難得多。在核酸復性研究中，定義了一個Cot的術語，(Co為單鏈DNA的起始濃度，t是以秒為單位的時間)，用以表示復性速度與DNA順序複雜性的關係。在探討DNA順序對復性速度的影響時，將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)對Cot作圖，可以得到如圖15－9所示的曲線。曲線上方為示複雜性的核酸分子的非重複鹼基對數。如多聚(A)的複雜性為1，重複的(ATGC)n組成的多聚體的複雜性為4，分子長度是105核苷酸對的非重複DNA的複雜性為105。原核生物基因組均為非重複順序，故以非重複核苷酸對表示的複雜性直接體現基因組大小(圖上方的箭頭所指為基因大小)，對於真核生物基因組中的非重複片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度，400核苷酸長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cot1/2)，與核苷酸對的複雜性成正比。對於原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的複雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重複序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲線更為複雜。

不同物種核酸的Cot曲線

圖15－9　不同物種核酸的Cot曲線

DNA的變性和復性原理，現已在醫學和生命科學上得到廣泛的應用。如核酸雜交與探針技術，聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction,PCR)技術等。

3.分子雜交：(hybridization)

不同來源的核酸變性後，合併在一處進行復性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成鹼基互補配對的片段，復性也會發生於不同來源的核酸鏈之間，形成所謂的雜化雙鏈(heterodup lex)，這個過程稱為雜交(hybridization)圖15-10，I)。雜交可以發生於DNA與DNA之間，也可以發生於RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。例如，一段天然的DNA和這段DNA的缺失突變體(假定這種突變是DNA分子中部丟失了若干鹼基對)一起雜交，電子顯微鏡下可以看到雜化雙鏈中部鼓起小泡。測量小泡位置和長度，可確定缺失突變發生的部位和缺失的多少。核酸雜交技術是目前研究核酸結構、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關係。其應用當然遠不止於確定突變位置這一例(圖15－10Ⅱ)。

核酸雜交及其應用示意圖

圖15－10　核酸雜交及其應用示意圖

Ⅰ.變性、復性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈

Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內是已缺失的部分；

D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡　Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記

在核酸雜交的基礎上發展起來的一種用於研究和診斷的非常有用的技術稱探針技術(Probe)。一小段(例如十數個至數百個)核苷酸聚合體的單鏈，有放射性同位素如32P、35S或生物素標記其末端或全鏈，就可作為探針。把待測DNA變性並吸附在一種特殊的濾膜，例如硝酸纖維素膜上。然後把濾膜與探針共同培育一段時間，使發生雜交。用緩衝液沖洗膜。由於這種濾膜能較牢固地吸附雙鏈的核酸，單鏈的在沖洗時洗脫了。帶有放射性的探針若能與待測DNA結合成雜化雙鏈，則保留在濾膜上。通過同位素的放射自顯影或生物素的化學顯色，就可判斷探針是否與被測的DNA發生雜交。有雜交現象則說明被測DNA與探針有同源性(homogeneity)，即二者的鹼基序列是可以互補的。例如：想知道某種病毒是否和某種腫瘤有關，可把病毒的DNA製成探針。從腫瘤組織提取DNA，與探針雜交處理後，有雜化雙鏈的出現，就說明兩種DNA之間有同源性。這不等於可以說這種病毒引起腫瘤，但至少這是可以繼續深入研究下去的一條重要線索。

探針技術(圖15－10Ⅲ)在遺傳性疾病診斷上已開始應用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有症状患者進行確診，還可以發現一些沒有症状的隱性遺傳性疾病。從胎兒的羊水也可以提取到少量DNA。由於探針技術比較靈敏，就使遺傳性疾病的產前診斷較為容易辦得到了。雜交和探針技術是許多分子生物學技術的基礎，在生物學和醫學的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應用。