熒光原位雜交
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熒光原位雜交方法是一種物理圖譜繪製方法，使用熒光素標記探針，以檢測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質的雜交。
熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術,以熒游標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結合,雜交後再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然後將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯的單株抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示於間期核.同時在熒光原位雜交基礎上又發展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.
對於利用rRNA的熒光原位雜交來說，如下原因可導致較低的熒光信號強度：
較低的細胞核糖體含量
較低的細胞周邊的通透性
較低的目標序列可接觸性（由於rRNA的摺疊產生的構象，有些位置與rRNA分子內其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸，從而使探針無法和目標序列雜交）
為檢驗細胞中的目標序列是否容易被探針雜交，及測試最佳雜交溫度，可利用「克隆熒光原位雜交」(clone-FISH)進行試驗：將rRNA基因結合入質體，轉化至大腸桿菌中表達，構成核糖體，再用熒游標記的探針雜交。
FISH可與流式細胞術聯用，對特定熒游標記的細胞進行計數或者分離。
熒光原位雜交（FISH）技術簡介
1974年Evans首次將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用，提高了定位的準確性。20世紀70年代後期人們開始探討熒游標記的原位雜交，即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上，標誌著染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的進行，由於繪製高分辨人類基因組圖譜的需要，FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。
1．原理
FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
2．實驗流程
FISH樣本的製備→探針的製備→探針標記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析。
3．特點
原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在於對製備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間解析度不高、及同位素操作較繁瑣等。採用熒游標記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，具有以下優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全；2、探針穩定，一次標記後可在兩年內使用；3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。
缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
4．應用
該技術不但可用於已知基因或序列的染色體定位，而且也可用於未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。
熒光原位雜交技術的發展歷程
1 FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展
在FISH 技術基本確立之後，FISH 不僅用於單基因或核酸檢測，FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測，從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測，並且在今後的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。早期的探針較大，是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引子DNA 合成法來製備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高熒光背景，採用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用於抑制非特異性雜交可以克服上述問題，同時也使得研究者擴大了檢測目標，實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交（Comparativegenomic hybridization）用於檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信號，混淆染色體上基因的檢測，就需要剪切成小片段＜200核苷酸。現在檢測手段的提高以及檢測軟體的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低，靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理演算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨著檢測目標越來越小，FISH技術已用於隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。
FISH 檢測範圍的擴大，使得FISH 技術的應用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是採用不同的熒光素來檢測多位點，如雙色熒光用於檢測特異的核酸序列，每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之後是採用兩種色彩解碼方案進一步擴大了FISH 應用範圍。解碼方案主要是針對色彩比例，即每一種顏色在總顏色中所佔的比例來描繪多位點。前述的每一種方法，或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。採用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術多位點檢測的里程碑。儘管可以採用多種方法觀測到mRNAs，但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有應用前景。色彩解碼技術已經實現了對整個組織的檢測。
2 FISH 技術的定量分析階段
Pinkel 等（1986）首次將熒光圖像定量分析用於基本細胞遺傳檢測，採用雙色激發塊裝置照相機檢測熒光信號，而且定量分析技術很快用於了mRNA 檢測。熒光檢測的關鍵是信號的重現性、無規律性及背景的自發熒光。不僅不同的樣品之間熒光不同，而且同一載玻片上的材料或者同樣的細胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用於消除一些組織中的自發熒光：如樣品製備過程中，採用的消除自發熒光試劑包括硼氫化鈉或者採用光照輻射進行預處理以消除非特異性背景信號。這些消除自發熒光的方法並不完全有效，通常在進行圖像分析時通過計算機算術除去自發熒光信號。熒光圖像的光譜數據包括真正的信號和許多雜噪，分別進行分析並且通過單獨的光譜組分分析除掉雜噪數據。多色FISH 有自身的限制，包括不同的熒光強度和顏色重疊。但是通過計算機演算法分析平衡了多色圖像，包括強度變化和自動糾正信號重疊。
FISH圖像自身的限制並沒有影響到自動破譯演算法的發展。採用序列較大探針進行DNA 位點檢測和多色熒光計數演算法輔助病理學家實現了自動化分析。此外，檢測探針試劑盒和點計數方法的應用為便捷的檢測結果提供了一個。儘管多種方法已經用於分析或優化自動細胞檢測系統，人工的細胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而，細胞製備、鑒別、固定介質上細胞樣品計算機化檢測在未來的醫學診斷中的高效益性不容忽視，快速檢測細胞內的分子信號只有通過計算機輔助方法進行檢測。現在，自動化檢測程序已經擴展到採用多基因轉錄模型檢測特異的DNA 簇和轉錄位點以確定功能細胞的狀態。
3 FISH 技術檢測領域的發展
鑒於FISH 起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展，熒光檢測技術將來的發展可能包括檢測領域的擴展。熒光圖像臨床診斷應用需要在檢測體系上進一步提高，如探針的結合，照相和分析的自動化，因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的雷射共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X 顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測範圍。活細胞的RNAs FISH 技術檢測也有報導。既可以採用體內釋放的熒光集團也可以採用雜交後探針的熒光素進行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標記探針存在時的高背景（如活細胞），可以用於追蹤mRNA 的合成和轉移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）更易於檢測不同靶分子。相對於GFP 活細胞原位雜交檢測，FISH 易受到細胞內合成探針的影響。FISH 需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的干擾背景，避免細胞內自身雜交物的干擾。其實完全可以不必考慮FISH 檢測和熒光檢測蛋白技術的差異，將FISH 技術和熒光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。
多光子顯微技術的應用進一步擴大了熒光圖像的應用範圍。採用多光子顯微鏡，雷射塊可以發射光子聚焦於顯微鏡兩到三次激發目的熒光素。採用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品，比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應用已將熒光圖像用於活體系統的檢測，甚至整個動物體。由於還不能合成生物體標記探針，因此目前生物體內熒光圖像的應用只限於檢測熒光分子或生物體自發熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產生的自發熒光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能，將會成為鑒別特異核酸序列，進行非入侵診斷，獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。
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