基礎檢驗學/脫落細胞標本採集和塗片製作方法

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一、標本採集

正確地採集標本細胞學診斷的基礎和關鍵之一,故要準確地選擇部位,儘可能在病變區直接採集細胞。採集的標本必須保持新鮮,儘快製得,以免細胞自溶或腐敗。儘可能避免血液、粘液等混入標本內,採集方法應簡便,操作輕柔,避免病人痛苦和引起嚴重併發症及促進腫瘤擴散,下面介紿幾種常用的標本採集方法。

(一)直視採集法

外陰、陰道陰道穹窿、宮頸、口腔肛管鼻腔鼻咽部、眼結膜皮膚等部位,可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸氣管和肺內支氣管則使用纖維內鏡在病灶處直接刷取細胞製片。

(二)自然分泌液的採集法

1.痰液塗片檢查:痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物,對支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細胞學診斷具有重要價值。

2.尿液塗片檢查:收集尿液中脫落的泌尿道細胞成分,作泌尿道腫瘤和某些疾病的細胞學診斷。

3.乳頭溢塗片檢查:用於導管內乳頭狀瘤乳腺癌細胞學檢查。

4.前列腺液塗片檢查:採用前列腺按摩法取得分泌物,作前列腺細胞學診斷。

(三)灌洗洗

向空腔器官或腹腔、盆腔(剖腹探查時)灌注一定量生理鹽水沖洗,使其細胞成分脫落於液體中,收集灌洗液離心製片,作細胞學檢查。

(四)磨擦法

利用磨擦工具在病變部位磨擦,將擦取物直接塗片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網套、氣囊等。可分別用於鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。

(五)針穿抽吸法

當有胸腔、腹腔、心包腔關節腔積液時,可用針穿抽吸部分積液作細胞學檢查。此外某些深部組織器官,如淋巴結甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細針穿刺吸取部分細胞進行塗片診斷。

二、塗片製作方法

(一)塗片前準備工作及塗片方法

1.塗片前準備工作

(1)保證標本新鮮,取材後儘快製片。

(2)塗操作要輕巧,避免擠壓以防止損傷細胞。塗片要均勻,厚薄要適度,太厚細胞堆疊,太薄細胞過少,均影響診斷。

(3)玻片要清潔無油漬,先用硫酸洗滌液浸泡沖洗,再用75%乙酸浸泡。

(4)含蛋白質的標本可直接塗片,缺乏蛋白質的標本,塗片前先在玻片上塗薄層粘附劑,以防止染色時細胞脫落,常用粘附劑為蛋白甘油,由等量生雞蛋白和甘油混合而成。

(5)每位患者的標本至少塗兩張玻片,以避免漏診。塗片後立即在玻片一端標上編號。

2.塗片製備方法

(1)推片法:用於稀薄的標本,如血液,胸、腹水等。取離心後標本一小滴滴在玻片偏右側端,用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。

(2)塗抹法:適用於稍稠的檢液,如鼻咽部標本。用竹棉簽在玻片上塗布,由玻片中心經順時針方向外轉圈淫抹;或從玻片一端開始平行塗抹,塗抹要均勻,不宜重複。

(3)壓拉塗片法:將標本夾於橫豎交叉的兩張玻片之間,然後移動兩張玻片,使之重疊,再邊壓邊拉,獲得兩張塗片。該法適用於較粘稠標本,如痰液。

(4)吸管推片法:用吸和將標本滴在玻片一端,然後將滴管前端平行置於標本滴上,平行向另一端均速移動滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用於胸、腹水標本。

(5)噴射法:用配細針頭的注射器將標本從左至右反覆均勻地噴射在玻片上,此法適用於各種吸取的液體標本。

(6)印片法:將切取的病變組織用手術切開,立即將切面平放在玻片上,輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。

(二)塗片的固定

固定(fication)的目的是保持細胞自然形態,防止細胞自溶和細菌所致的腐敗;固定液能沉澱和凝固細胞內蛋白質和破下細胞內溶酶體酶,使細胞不但保持自然形態,而且結構清晰,易於著色。因此標本愈新鮮,固定愈及時,細胞結構愈清晰,染色效果愈好。

1.固定液:細胞學檢查常用的固定液有下列三種:第一種乙醚酒清固定液:該固定液滲透明性較強,固定效果好適用于于一般細胞學常規染色;二種是氯仿酒精固定液:又稱卡諾氏固定液。其優點同上;第三種95%酒精固定液:適用於大規模防癌普查。製備簡單。但滲透作用稍差。

2.固定方法

(1)帶濕固定:塗片後未待標本乾燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細胞結構清楚,染色新鮮。適用於巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網塗片等常任常用此方法。

(2)乾燥因定:塗片後未待其自然乾燥,再行固定。適用於稀薄標本如尿液、胃沖洗液等,也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。

3.固定時間:一般為15-30min。含粘液較多標本,如痰液、陰道分泌物、食管拉網等因定時間在適當延長;尿液、胸、腹水等塗片不含粘液,固定時間可酌情縮短。

(三)塗片的染色

1.染色的目的和原理:染色的日的是藉助於一種或多種染料,使組織和細胞內結構分別著不同的染色,這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細胞內部結構,作出正確判斷。

組織細胞染色原理至今尚無滿意的解釋,可能是物理作用,也可能是化學作用,或者是兩者綜合作用的結 果。

染色的物理作用是利用毛細管現象,滲透、吸收和吸附作用,使染料的色素顆粒牢固地進入組織細胞,並使其顯色。

染色的化學作用是滲入組織細胞的染料與其相應的物質起化學反應,產生有色的化合物

各染料都具有兩種性質,即產生顏色;徵收被組織形成親和力。這兩種性質主要由發色基因和助色基因所產生的。

發色基團:苯的衍生物具有可見光區吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價鍵的不穩定性有關,如對苯二酚為無色,當其氧化後失去兩個氫原子,它的分子或則變為有黃色的對醌,這種產生顏色的醌式環稱為發色基團。若一種化合物含有幾個環,只要其中有一個醌式環就會發出顏色,稱此發色基團為色原(chromogen).

助色基團:是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團(酸鹼性基團)。它能使染色的色澤進一步加深,並使其與被染色組織具有親和力。

助色基團的性質決定染料是酸性鹼性。鹼性染料具有鹼性助色基團,在溶媒中產生的帶色部分為帶正電荷的陽離子,吻與組織細胞內帶負電荷的物質結合而顯色。如細胞核內的主要化學成分脫氧化核核酸易被蘇木素染成紫藍色,稱嗜鹼性。酸性染料具有酸性用力色基團,在溶酶中產生帶色部分為陰離子,易與組織細胞內帶正電荷部分結合而顯色,此性質被稱為嗜酸性,如細胞漿內訂成分為蛋白質,易與伊紅或橘黃結合呈紅色或橘黃色。

2.常用染色方法:臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種:

(1)巴氏染色法:本法染色特點是細胞具有多色性顏色,色彩鮮艷多彩。塗片染色的透明性好,胞質顆粒分明,胞核結構清晰,如鱗狀上皮過度角化細胞胞質呈橘黃色;角化細胞顯粉紅色;而角化前細胞顯淺綠色或淺藍色,適用於上皮細胞染色或觀察陰道塗片中激素水平對上皮細胞的影響。此方法的缺點是染色程序比較複雜。

(2)蘇木精—伊紅(hemotoxylin eosin,HE)染色法:該方法染色透明度好,核與胞質對比鮮明。染色步驟簡便,效果穩定。適用於痰液塗片,觖質核呈紫藍色,胞質淡玫瑰紅色,紅細胞呈淡硃紅色。

(3)瑞特—吉姆薩染色法(wrightgiemsa atain);本方法多用於血液,骨髓細胞學檢查。胞質內顆粒與核安危質結構顯示較清晰。操作簡便。

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