基礎檢驗學/脫落細胞標本採集和塗片製作方法

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臨床基礎檢驗學

脫落細胞檢查
- 脫落細胞檢查技術
  - 脫落細胞標本採集和塗片製作方法
  - 脫落細胞塗片的觀察與診斷

一、標本採集

正確地採集標本是細胞學診斷的基礎和關鍵之一，故要準確地選擇部位，儘可能在病變區直接採集細胞。採集的標本必須保持新鮮，儘快製得，以免細胞自溶或腐敗。儘可能避免血液、粘液等混入標本內，採集方法應簡便，操作輕柔，避免病人痛苦和引起嚴重併發症及促進腫瘤擴散，下面介紿幾種常用的標本採集方法。

（一）直視採集法

外陰、陰道、陰道穹窿、宮頸、口腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼結膜及皮膚等部位，可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸、氣管和肺內支氣管則使用纖維內鏡在病灶處直接刷取細胞製片。

（二）自然分泌液的採集法

1．痰液塗片檢查：痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物，對支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細胞學診斷具有重要價值。

2．尿液塗片檢查：收集尿液中脫落的泌尿道細胞成分，作泌尿道腫瘤和某些疾病的細胞學診斷。

3．乳頭溢塗片檢查：用於導管內乳頭狀瘤和乳腺癌細胞學檢查。

4．前列腺液塗片檢查：採用前列腺按摩法取得分泌物，作前列腺細胞學診斷。

（三）灌洗洗

向空腔器官或腹腔、盆腔（剖腹探查時）灌注一定量生理鹽水沖洗，使其細胞成分脫落於液體中，收集灌洗液離心製片，作細胞學檢查。

（四）磨擦法

利用磨擦工具在病變部位磨擦，將擦取物直接塗片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網套、氣囊等。可分別用於鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。

（五）針穿抽吸法

當有胸腔、腹腔、心包腔及關節腔積液時，可用針穿抽吸部分積液作細胞學檢查。此外某些深部組織器官，如淋巴結、甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細針穿刺吸取部分細胞進行塗片診斷。

二、塗片製作方法

（一）塗片前準備工作及塗片方法

1．塗片前準備工作

（1）保證標本新鮮，取材後儘快製片。

（2）塗操作要輕巧，避免擠壓以防止損傷細胞。塗片要均勻，厚薄要適度，太厚細胞堆疊，太薄細胞過少，均影響診斷。

（3）玻片要清潔無油漬，先用硫酸洗滌液浸泡沖洗，再用75%乙酸浸泡。

（4）含蛋白質的標本可直接塗片，缺乏蛋白質的標本，塗片前先在玻片上塗薄層粘附劑，以防止染色時細胞脫落，常用粘附劑為蛋白甘油，由等量生雞蛋白和甘油混合而成。

（5）每位患者的標本至少塗兩張玻片，以避免漏診。塗片後立即在玻片一端標上編號。

2．塗片製備方法

（1）推片法：用於稀薄的標本，如血液，胸、腹水等。取離心後標本一小滴滴在玻片偏右側端，用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。

（2）塗抹法：適用於稍稠的檢液，如鼻咽部標本。用竹棉簽在玻片上塗布，由玻片中心經順時針方向外轉圈淫抹；或從玻片一端開始平行塗抹，塗抹要均勻，不宜重複。

（3）壓拉塗片法：將標本夾於橫豎交叉的兩張玻片之間，然後移動兩張玻片，使之重疊，再邊壓邊拉，獲得兩張塗片。該法適用於較粘稠標本，如痰液。

（4）吸管推片法：用吸和將標本滴在玻片一端，然後將滴管前端平行置於標本滴上，平行向另一端均速移動滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用於胸、腹水標本。

（5）噴射法：用配細針頭的注射器將標本從左至右反覆均勻地噴射在玻片上，此法適用於各種吸取的液體標本。

（6）印片法：將切取的病變組織用手術切開，立即將切面平放在玻片上，輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。

（二）塗片的固定

固定（fication）的目的是保持細胞自然形態，防止細胞自溶和細菌所致的腐敗；固定液能沉澱和凝固細胞內蛋白質和破下細胞內溶酶體酶，使細胞不但保持自然形態，而且結構清晰，易於著色。因此標本愈新鮮，固定愈及時，細胞結構愈清晰，染色效果愈好。

1．固定液：細胞學檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清固定液：該固定液滲透明性較強，固定效果好適用于于一般細胞學常規染色；二種是氯仿酒精固定液：又稱卡諾氏固定液。其優點同上；第三種95%酒精固定液：適用於大規模防癌普查。製備簡單。但滲透作用稍差。

2．固定方法

（1）帶濕固定：塗片後未待標本乾燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細胞結構清楚，染色新鮮。適用於巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網塗片等常任常用此方法。

（2）乾燥因定：塗片後未待其自然乾燥，再行固定。適用於稀薄標本如尿液、胃沖洗液等，也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。

3．固定時間：一般為15-30min。含粘液較多標本，如痰液、陰道分泌物、食管拉網等因定時間在適當延長；尿液、胸、腹水等塗片不含粘液，固定時間可酌情縮短。

（三）塗片的染色

1．染色的目的和原理：染色的日的是藉助於一種或多種染料，使組織和細胞內結構分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細胞內部結構，作出正確判斷。

組織細胞染色原理至今尚無滿意的解釋，可能是物理作用，也可能是化學作用，或者是兩者綜合作用的結　果。

染色的物理作用是利用毛細管現象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進入組織細胞，並使其顯色。

染色的化學作用是滲入組織細胞的染料與其相應的物質起化學反應，產生有色的化合物。

各染料都具有兩種性質，即產生顏色；徵收被組織形成親和力。這兩種性質主要由發色基因和助色基因所產生的。

發色基團：苯的衍生物具有可見光區吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價鍵的不穩定性有關，如對苯二酚為無色，當其氧化後失去兩個氫原子，它的分子或則變為有黃色的對醌，這種產生顏色的醌式環稱為發色基團。若一種化合物含有幾個環，只要其中有一個醌式環就會發出顏色，稱此發色基團為色原（chromogen）.

助色基團：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團（酸鹼性基團）。它能使染色的色澤進一步加深，並使其與被染色組織具有親和力。

助色基團的性質決定染料是酸性鹼性。鹼性染料具有鹼性助色基團，在溶媒中產生的帶色部分為帶正電荷的陽離子，吻與組織細胞內帶負電荷的物質結合而顯色。如細胞核內的主要化學成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍色，稱嗜鹼性。酸性染料具有酸性用力色基團，在溶酶中產生帶色部分為陰離子，易與組織細胞內帶正電荷部分結合而顯色，此性質被稱為嗜酸性，如細胞漿內訂成分為蛋白質，易與伊紅或橘黃結合呈紅色或橘黃色。

2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種：

（1）巴氏染色法：本法染色特點是細胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。塗片染色的透明性好，胞質顆粒分明，胞核結構清晰，如鱗狀上皮過度角化細胞胞質呈橘黃色；角化細胞顯粉紅色；而角化前細胞顯淺綠色或淺藍色，適用於上皮細胞染色或觀察陰道塗片中激素水平對上皮細胞的影響。此方法的缺點是染色程序比較複雜。

（2）蘇木精—伊紅（hemotoxylin eosin,HE）染色法：該方法染色透明度好，核與胞質對比鮮明。染色步驟簡便，效果穩定。適用於痰液塗片，觖質核呈紫藍色，胞質淡玫瑰紅色，紅細胞呈淡硃紅色。

（3）瑞特—吉姆薩染色法（wrightgiemsa atain）；本方法多用於血液，骨髓細胞學檢查。胞質內顆粒與核安危質結構顯示較清晰。操作簡便。