醫院藥學/毒性實驗法

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醫院藥學

醫院藥品檢驗

（一）概述某一種新藥或一個的製劑，於臨床使用前，必須經過這個步驟。雖然藥物對人的作用，不完全能在動物身上表現出來，但對一個藥物來說仍是一個很有用的參考數據。因此，為保證病人的用藥安全，新藥在臨床應用前一定要進行毒性試驗。毒性試驗的類型，可根據藥物的性質及使用途徑、方法和時間等加以選擇。如有的藥物後則產生中毒症状；有的藥物需長期服用才能秦效等。因此，藥物的毒性試驗，應根據該藥物的特點來決定。

（二）急性毒性試驗（一般安全試驗）取體重18-22g的健康不白鼠5隻，由尾靜脈（或腹腔）注射一定劑量的藥液（容量以0.5ml為宜，可用注射生理水稀釋成不同濃度），注射時間為4-5秒，觀察有無不良反應（如驚厥、四肢癱瘓、步伐不穩、豎毛、呼吸抑制等）或死亡。主要以死亡為指標，注射後48小時內不得有死亡。如有死亡應加取小白鼠10隻重新試驗，全部小白鼠在48小時內不得有死亡（做過本試驗的小白鼠不得重複使用）。

【注】①供試品靜脈有困難時，可由腹腔注射，注射量仍為0.5ml，注射時間不限，注射後72小時內不得有死亡。

②若某一藥物無安全試驗劑量時，可將臨床人用劑量乘以一定的安全係數然後再折算成小白鼠體重的劑量。安全係數大小，應根據該藥物的純度及臨床試驗情況而定，一般治療性藥物可定為50－100，需長期服用的藥物可為100以上。

例：某注射液，成人（按體重50kg計），每次注射量為4ml，安全係數為50，則小白鼠（按20g計）的給藥劑量為：

小鼠劑量＝4×50／50000×20＝0.08ml

取該藥0.08ml加0.9％氯化注射液稀釋成0.5ml，作為供試品的注射用量。

③也可用同樣方法試驗（即某一劑量注入小白鼠內，若5隻中只有1隻死亡，則減劑量再試直至試出5隻小白鼠均不死亡的最大劑量）。求出某藥物的安全係數。

計算公式：

安全係數＝小白鼠最大耐受量×成人體重（g）／成人用量×小白鼠體重（g）。

例：某藥特的劑量為4ml，當劑量為0.2ml（稀釋至0.5ml），給小白鼠靜脈注埋時引起死亡，減劑量再試，在0.16ml/20g時，沒有反應，故含有苯甲醇的注射劑，對試驗往產生干擾，應引起注意。

④苯甲醇對小白鼠有一定毒性反應，故含有苯甲的注射劑，對試驗結果往往產生干擾，應引起注意。

（三）亞急性和慢性試驗需要較長期投用的藥物，應做亞急性或慢性毒笥試驗。方法和急性毒性試驗基本相同，按小白鼠體重計算，每在在口服或腹腔注射劑量為人用劑量的20－50倍，連續用藥1－8周。慢性毒性，連續用3-6個月。在用藥期間，應仔細觀察試驗動物的體重、進食量、進水量的變化，以及有無不良反應或死亡。動物在試驗前後，均應做血象、肝、腎等功能檢查，以資對照。試驗中死亡或試驗完畢的動物都要做解剖，觀察內臟器管和組織切片檢查。根據試驗結果，判斷可否用於臨床。

【注】①亞急性，慢性毒性試驗，均應設對照。這是由於的飼養環境和健康情況的不同個體差異往往很大，給藥後內髒的變化如無空白對照組做比較，常使實驗結果難以判斷。

②非經口服的藥品，應注意須滅菌後作用，以免動物被染而影響結果。

③毒性實驗的給藥途徑，應盡量採用與臨床應用的相同方法。給藥途徑不同毒性表現常是差別很大，如口服給藥的LD50比靜脈或腹腔注射的LD50大幾十倍。

④毒性實驗前，實驗設計要考慮周密，應儘力避免實驗中臨時改變條件。實驗用的動物，一般應在本實驗室條件下2周以上，使動物適應環境後，再進行實驗。

⑤實驗室要注意加強對動物的管理，保持清潔衛生。對實驗中途死亡的動物應做出客觀的分析，以便正確總結判斷。

⑥毒性實驗中，除記錄計量指標外，支動物的一般狀態如興奮、抑制、麻痹、呼吸、食慾、體重等應進行仔細地觀察、對實驗中藥物出現作用的時間，速度以及毒副作用的特點等，均應嚴密觀察，並詳細記錄，以便進行綜合分析。

⑦在亞急性、慢性毒性實驗中，應根據藥物的性質和實驗要求的不同，在給藥前後以及實驗時，對實驗動物易發生毒性反應的主要器官進行檢查。檢查項目有：

A血象：包括血色紅素、紅、白細胞及分類計數等。

B肝功能：肝臟是機體重要的代謝器官，不僅對糖、蛋白質及脂類代謝起得要作用，也是許多藥物在體內的解毒場所，故應進行肝臟功能的檢查。

C腎功能：大部分藥物從腎臟排泄，故應測定藥物對腎功能有無損害及其損害的程度，其中包括血中非蛋白氮含量，小便常規檢查。

D組織切片：可進一步了解藥物對各臟器有無損害及其損害的程度。可將動物在不同的期內分批處死、取其心，肝、脾、肺腎、胃、腸等進行切片檢查，並與對照比較，觀察藥物對各組織有無可逆或不可逆損害。

（四）半數致死量的測定半數致死量（簡稱LD50）是指藥物引起實驗動物半數死亡的劑量。由於個體差異，同一劑量的藥物給同一動物，可以出現死亡或不死亡。而LD50在表示藥物毒性時，比較靈敏，準確。一般以每kg多少mg表示（藥物劑量／體重）

測定LD50常用動物為小白鼠，體重18-22g，雄雌均可（雌的不得懷孕）將不同性別和體重的動物均勻分成4或6組，每組10隻。給藥途徑和臨床應用相同，給藥容量以0.5ml為宜。一般觀察3天，以死亡為主要指標。

1．機率單位比例法精密稱取適量的檢品（如系溶液可精密量取），按等比級數（0.1、0.3、0.9……）或等差級數（0.1、0.2、0.3……）配成4種或6種濃度，分別用於4組或6組小白鼠，觀察在一定時間內死亡情況，找出使小白鼠死亡數在50％以上和50％以下的兩個劑量（如各組小白鼠均無死亡或全死亡則表示劑量選擇不當，須更換較高或料低劑理重試），按下列公式計算出半數致死量。

M＝高劑量的對數值

N＝低劑量的對數值

A＝高劑量所致小白鼠死亡百分率（大於50％）的機率單位

B＝低劑量所致小白鼠死亡百分率（小於50％）的機率單位

5＝50％死亡百分率的機率單位

例：烏頭鹼注射液急性毒性試驗結果。見下表。

烏頭鹼注射液急性毒性試驗結果

劑量(mg/kg)	劑量對數值	死亡百分率	機率單位
29.50	1.4698	90	6.28
23.75	1.3756	40	4.7

LD50=24.60mg/kg

2．簡化機率單位法

（1）劑量預試：取小白鼠9隻，均分3組，將被試藥物分大中小3個劑量，每個劑量各給1組動物觀察一定時間的死亡情況。如3組全死或全不死，應重新選擇劑量再試，二至找到死亡率大於和小於50％的劑量。

（2）正式試驗：取18-22g的健康小白鼠，雌雄兼有，按體重、性別均勻分組，每級10隻。將預試中的找到的劑量範圍按等比級數分成2-4個劑量（須有使動物死亡率大於50％和小於50％的兩種劑量），劑量間的比例範圍內為宜。每個劑量各給1組動物。給藥生觀察3天（有的可延長到7天），記錄動物的一般狀態和死亡數目。根據各劑量的組的死亡率，簡化機率單位求出LD50，其分工如下：

式中I為相鄰兩劑量比值（高劑量分子）的對數：y為各組死亡率相應的機單位；y為各機率單位的平均數；X₁為小劑量的對數值。

【注】用本法則定藥物的LD50，在一般情況下採用兩組即可，將實驗果代入分組時的公式中求出。分組、4組皆可，分組多，用動物多，計算複雜，但更準確。

例：某新藥，要測定對小白鼠口服給藥的LD50，首先進行劑理預試，將該藥物先分為700、800和1000mg/kg3種劑量，每劑量給3隻小白鼠灌胃，觀察2天，結果700 mg/kg組死亡1隻，800 mg/kg組殘廢只，1000 mg/kg組全部死亡。這樣，就找到了死亡率小於50％的劑量為700 mg/kg；大於50％的劑量為800和1000 mg/kg，依上述情況。估計用670和800 mg/kg可使動物死亡20％和60％左右，兩組劑量之比670／800為0.84。符合本法劑量比值範圍的要求。若分組時用此兩劑量可以實驗；若用3組時，可按同樣的劑量比求出第三組劑量，即800／0.84＝952。這樣，670、800和952 mg/kg3個劑理組即成等比級數，其中每相鄰兩劑量比均為0.84。然後各劑量的組均給10隻動物，觀察3天，記錄動物的一般狀態和死亡情況，結果如下表：

LD50實驗觀察表

組別	劑量（mg/kg）	劑量對數（X）	鼠數	三天內死亡數	死亡率（％）	機率單位(y)	機率單位平均值(y)	兩劑量比值的對數（i）
1	670	2.8261	10	2	20	4.16
2	800	2.9031	10	8	70	5.52	5.32	0.77
3	952	2.9786	10	9	90	6.28