基因診斷與性病/PCR擴增產物的分析法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術（PCR）
  - PCR的基本原理和基本程序
  - PCR的特點
  - PCR方法
  - PCR反應的基本條件及其對PCR的影響
  - PCR標本的製備
  - PCR實驗中常見問題對策
  - PCR擴增產物的分析法

PCR擴增 DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而採用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助於擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助於產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助於產物的精確分析。

（一）凝膠電泳分析法

PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷後倒入電泳槽。

電泳後，用溴化乙淀染色20min，然後用去離子水漂洗2次，每次min，於UV燈下觀察結果並拍照。

凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。

（二）點雜交

當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關係起了很大的作用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。

（三）微孔板夾心雜交法

該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定於微孔板上。然後，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗後顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV的檢測，其敏感度可達5個HBvDNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常規應用的ELISA,適於臨床實驗室常規應用。

（四）PCR-ELISA法

本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾後仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引子的5′端使其攜帶便於PCR產物固定的功能基因，而通過另一引子5′-端的修飾使產物便於檢測。