基因診斷與性病/PCR方法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術（PCR）

基因診斷與性傳播疾病目錄

（一）試劑

（1）引子：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引子，每種病原微生

物都有自己特異的引子。

（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。

（3）10×PCR緩衝液：500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩衝液隨酶一起購買。

（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合併，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。

（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。

（二）操作程序

過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應成份分別加入一微量離心管中，然後置於一定的循環參數條件下進行循環擴增。具體如下：

（1）向一微量離心管中依次加入

DNA模板 10²-10⁵拷貝

引子　各1μmol/L

dNTP　　各200μmol/L

10×PCR緩衝液1/10體積

ddH₂O　補到終體積（終體積50μl-100μl）

混勻後，離心15s使反應成分集於管底。以上步驟僅在實驗研究用，現在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩衝液，引子，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。

（2）加石蠟油50-100μl於反應液表面以防蒸發。置反應管於97℃變性10min。

（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。

（4）PCR的循環程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然後在72℃延伸30s，共循環30-35次。最後一次循環結束後，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。

PCR尚可用於組織標本DNA的擴增。由於固定組織標本的DNA常發生降解，就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應用這種方法，他們成功地從保存30至40年久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊製成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘餘二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然後按前述PCR方法進行DNA擴增。

在應用PCR方法檢測RNA 病毒時，首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄，反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。