基因診斷與性病/PCR反應的基本條件及其對PCR的影響

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術（PCR）
  - PCR的基本原理和基本程序
  - PCR的特點
  - PCR方法
  - PCR反應的基本條件及其對PCR的影響
  - PCR標本的製備
  - PCR實驗中常見問題對策
  - PCR擴增產物的分析法

（一）模板核酸

PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉錄成cDNA後才能進行PCR循環。不同來源的核酸標本必須經處理後才能用於PCR的擴增，處理不當或處理過程中DNA掉失都會導致PCR擴增失敗。採集標本方法不當，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導致出現假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導致擴增失敗。

（二）引子

PCR結果的特異性取決於引子的特異性，擴增產物的大小也是由特異引子限定的。因此，引子的設計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引子必須經聚丙烯醯胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引子中會有相當數量的「錯誤序列」，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產物以及可檢測到的鹼基修飾的完整鏈和高分子量產物。這些序列可導致非特異擴增和信號強度的降低。因此，PCR所用引子質量要高，且需純化。凍干引子於-20℃至少保存12-24個月，液體狀態於-20℃可保存6個月。引子不用時應存於-20℃保存。

PCR反應中引子的量也影響PCR擴增效果，當PCR引子量太低，則產物量降低，會出現假陰性。引子濃度過高會促進引子的錯誤引導非特異產物合成，還會增加引子二聚體的形成。非特異產物和引子二聚體也是PCR反應的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。一般認為PCR反應中引子的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發現，最適濃度遠遠低於此濃度。

（三）緩衝液

PCR反應的緩衝液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。目前最為常用的緩衝體系為10-50mmol/L　Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩衝液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化於6.8-7.8之間。改變反應液的緩衝能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產量。

反應混合液中50mmol/L以內的KCl，pH8.9有利於引子的退火，50mmol/lNaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0.01%）或Tween20（0.05% ～0.1%）有助於酶的穩定，反應中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護劑對PCR反應是有利的。

（四）Mg2+

Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引子的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度，產物的特異性，引子二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導致非特異性擴增產物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引子和dNTp的磷酸基團均可與Mg2+結合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。

（五）三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）

四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應中dNTP含量太低，PCR擴增產量太少、易出現假陰性。過高的dNTP濃度會導致聚合將其錯誤摻入（即所謂的「熱力背信」），因此應當避免。一般認為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質量也直接影響PCR反應的成敗。

（六）耐熱DNA聚合酶

PCR之所以能得到廣泛應用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴增效率。該酶的最適溫度很高（79℃），使引子在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應的總強度並減少了與錯配引子的延伸。在PCR反應中，每100μl反應液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產物產量降低，如果酶的濃度太高則會出現非特異性擴增。Taq DNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。

（七）溫度循環參數

1．變性溫度與時間

PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開，才能有效的和引子結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響TaqDNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第一個循環變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。

2．復性溫度與時間

變性溫度是PCR反應成敗的關鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是容易出現引子與靶DNA的錯配，增加非特異性結合，溫度太高不利於復性，大多數PCR反應的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度後，復性時間並不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。

3．延伸溫度與時間

引子延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引子和靶基因的結合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性，也會影響其產量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決於緩衝體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對於長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。

4．循環數：

循環數決定著擴增的產量。在其它參數都已優化條件下，最適循環數取決於靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環次數。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環次數、以便達到有效的擴增量。