臨床生物化學/藥物濃度測定常用技術

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臨床生物化學

治療藥物監測
- 概論
- 藥代動力學基礎及有關參數的應用
- 合理使用治療藥物監測應考慮的基本因素
- 治療藥物監測的臨床應用
- 治療藥物監測常用標本及預處理
- 藥物濃度測定常用技術
- 需測定藥物濃度進行監測的主要藥物

從本質上說，藥物都是化學物質，其檢測方法均為臨床化學的常用技術。但體液中的藥物大多以μg/ml或ng/ml水平存在，並且其檢測不僅受同時存在的多種結構相似的內源性物質干擾，還受和原型藥僅有微小差別的代謝物干擾。而某些藥物的TDM除原型藥外，還需同時檢測具藥理活性的代謝物。另一方面，藥物的有效濃度範圍和中毒水平，是結合大量臨床觀察確定的，要求任何實驗室建立的測定方法應具有高度可比性。下面將僅結合藥物測定的特殊要求，對常用臨床化學技術作一評估性介紹。

（一）光譜法

多數藥物或代謝物本身在紫外光區即存在吸收峰，一些藥物或代謝物受激發後，本身即可發射熒光；而另外一些藥物還可通過特異的顯色反應用分光法檢測。但無論可見光分光光度法、紫外光度法還是熒光光度法，用於體液中藥物檢測時，都存在靈敏度低、特異性差的缺點，特別是易受代謝物干擾。雖然採用提取、雙波長、示差、導數分光光度法等試圖提高其靈敏度和特異性，仍未能從根本上克服上述缺點。但光譜法操作簡便，所需儀器一般臨床實驗室都具備，檢測成本低，便於推廣。對治療血藥濃度水平較高，經適當方法改良光譜法能滿足臨床需要的藥物，現階段仍不失為一可採用的方法，如阿司匹林、對乙醯氨基酚、氨茶鹼、苯妥英鈉、苯巴比妥鈉等。

火焰發射光譜法和原子吸收光譜法特異性及靈敏度均高，操作也較簡便，但僅能用於某些含體內僅微量存在的金屬離子藥物。在TDM中可供鋰鹽、鉑鹽檢測用。

（二）色譜法

又稱層析法。系通過層析作用，使樣品中理化性質不同的組分得以分離，若再配以適當的檢測器，則可同時完成定性、定量工作。特異性高，可同時檢測同一樣本中的不同組分，是色譜法的共同優點，這在TDM中尤有意義。薄層色譜法（TLC）雖然不斷改進定量點樣技術並使用掃描定量，但其靈敏度及重複性仍低於其他色譜法，除用於毒物的檢測外，在TDM工作中較少應用。

自60年代末期相繼發展成熟的氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC），由於實現了高效層析分離和檢測聯機，可用微電腦控制層析條件、程序和數據處理，其特異性、靈敏度和重複性均好，並可一次同時完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測。若採用內標本法定量，還可排除部分操作誤差，提高檢測結果的可靠性。HPLC和GC相比，由於不需對樣品高溫氣化，一般都可不進行衍生化處理；另一方面，HPLC的固定相種類較多，流動相通過改變其組成成分及比例更是千變萬化。二者適當組合，可對絕大多數有機化合物藥進行分離測定。事實上，正是GC和HPLC這類先進可靠的檢測方法的應用，促進了TDM的形成和發展。特別是HPLC已成為TDM的重要檢測技術，並常用作評估其他方法的參考方法。當然，GC和HPLC一般均要求對樣品進行預處理，兩法所用儀器都昂貴尚難普及。但從發展的觀點看，HPLC仍將成為國內TDM的主要分析方法。近年來發展的GC-質譜、HPLC-質譜聯機檢測，更使這類分析手段的性能極大提高。

（三）免疫化學法

不少藥物都是半抗原或抗原，所以可引起過敏反應。若能製備這些藥物相應的特異性抗體，即可根據抗原-抗體反應的特異性，應用免疫化學法檢測這些藥物。TDM應用的免疫化學法一般都採用競爭性免疫分析，即通過定量加入的少量特異性抗體，與標本中相應的抗原或半抗原性藥物及定量加入的標記藥物間，產生競爭性結合，檢測標記藥物與抗體結合的抑製程度，和同樣處理的標準管比較，便可對樣本中的藥物定量。免疫化學法靈敏度極高，大多可達ng甚至pg檢測水平，可滿足所有藥物TDM的要求；該法所需標本量少，一般均不需預處理，操作簡便，並可製成商品化試劑盒；還可利用一般生化、熒光自動分析儀進行自動化操作。這些都是免疫化學法的優點。

但在TDM中免疫法存在的主要問題是，特異性易受干擾。干擾因素除來自內源性物質外，特殊的是抗原性決定基團未發生變化的待測藥物的代謝，或具相同相似抗原性的其他藥物及代謝物。如強心藥地高辛、洋地黃毒甙、地高辛代謝物二氫地高辛，均可與地高辛抗體結合。顯然，在體內幾乎不發生代謝轉化而原型排泄的藥物，則較少代謝物干擾，尤其適用於免疫法檢測，如慶大黴素等氨基甙類抗生素。當然，只有具備完全或半抗原性的藥物，並要能製備特異性抗體，才能用免疫化學法進行TDM。但總的來說，由於免疫化學法的前述優點，仍是TDM檢測技術發展的主要方向。

免疫化學法根據標記物性質不同，可分做放射免疫法、熒光免疫法和酶免疫法三類。根據測定中是否要分離與抗體結合和未結合的標記物，又可分為多相（需分離）和均相（不分離）免疫分析法兩種。放射免疫法雖存在放射性污染，又是多相體系，分離結合和未結合標記物操作繁雜，影響因素多，而分離效果又直接影響測定結果，但其靈敏度高，標記技術相對成熟，國內生產的TDM試劑盒多為此類。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，並且大多操作簡便，便於推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬於此類，並且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。酶免疫分析法是目前國外TDM免疫分析中最常採用的方法，特別是均相酶免疫分析法。本法除具有熒光免疫法的優點外，通過選用合適的標記酶，在目前已較廣泛普及的多種自動化分析儀即可實現自動化操作，更利於推廣。特別是近年來，在TDM的酶免疫分析中，應用酶偶聯反應原理，以輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）標記藥物，將葡萄糖氧化酶蛋白、偶聯輔助酶－過氧化物酶及底物和顯色劑4-氯-1-萘酚固化在薄膜上，製成類似pH試紙樣的試條。測定時，只要滴上微量樣品，根據成色深淺，即可作出藥物濃度的粗略判別。這一方法使病人自我或臨床醫師病床旁方便快速進行TDM工作成為可能。目前國外已有供茶鹼和苯妥英鈉測定用的這種試條問市。無疑這一方法的推廣，將有助於促進TDM的普及，具有良好的發展前景。