臨床生物化學/樣品預處理

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臨床生物化學

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TDM工作中,除少數方法可直接應用收集的標本供測定外,大多需進行必要的預處理。預處理的目的是在不破壞欲測定藥物的化學結構的前提下,用適當的方法盡量減少干擾組分,濃縮純化待測物,以提高檢測的靈敏度及特異性,並減少對儀器的損害。預處理包括去蛋白、提取和化學衍生化。

(一)去蛋白

TDM常用的血清(漿)、唾液或尿液等都或多或少地含有蛋白質,並對多種測定方法構成干擾,還可造成儀器污染、損害。去蛋白的方法有沉澱離心法、層析法超濾法和超速離心法等。其中以沉澱離心法最為簡便快捷,並且結合提取的要求,選用合適的酸、鹼和有機溶劑,與提取同步進行,故最常選用。由於藥物和血漿蛋白的結合,大多是通過離子鍵、氫鍵、VanderWaals引力等較弱的作用力形成。當使蛋白質變性沉澱時,這種結合也同時被破壞,釋放出藥物,因此用沉澱離心法去蛋白處理的體液標本,最後測得的藥物濃度應是包括游離藥物和與蛋白結合的藥物兩部分的總濃度。顯然,若需要單獨測定游離藥物濃度時,不能採用此法,而應選用溫和但較繁雜、耗時的層析法、超濾法或超速離心法。這樣既可去除蛋白,又不至使蛋白結合的藥物釋出。

(二)提取

為了儘可能選擇性地濃縮待測組分,以提高檢測的靈敏度,並改善檢測方法的特異性,減少干擾,除免疫化學法外,TDM使用的多數檢測方法均需進行提取。提取方法有液-液提取和液-固提取兩種。

⒈液-液提取由於大多數藥物都是有機化合物,並有不少為弱酸弱鹼。它們在pH不同的溶液中,將發生程度不等的解離。因此,應選用對待測物溶解度高、與所用標本不相混溶也不發生乳化的有機溶劑,並根據待測物的酸鹼性和pKa,酸化或鹼化樣本,使待測物儘可能多地以脂溶性高的分子態存在,從而主要分配到有機溶劑中。這樣處理,可使在此條件下極性高的干擾成分被排除。離心分離有機相和水相(樣本),即可達到提取的目的。若必要,可按上述原理將待測成分再轉提到pH適當的水相中,進一步排除高脂溶性的干擾物質。這類方法由於樣本和提取介質均為液相,故稱液-液提取。

⒉液-固提取又稱固相柱提取,是近年發展的一種提取方法。可根據待測物的理化性質選用一合適的常壓短色譜柱,TDM中常用疏水性填料柱。待標本(多經去蛋白處理)通過該柱後,以適當強度的溶劑洗脫,選擇性收集含待測組分的洗脫液部分,即可達到較理想的提取目的。也可用強度不同的溶劑分次洗脫,僅收集洗脫待測組分。此類提取柱已有數種商品化生產,可供選用。本法雖比液-液提取繁瑣,但回收率及提取特異性均高是其優點。

(三)化學衍生化反應

用光譜法和色譜法檢測藥物時,可根據待測物的化學結構和檢測方法的要求,通過化學衍生化反應,特異性地引入顯色(可見光分光法)、發光(紫外、熒光、磷光)基團,提高檢測的靈敏度和特異性。氣相層析時,常需使待測物矽烷化、烷化、鹵化和醯化等,以增加待測物的熱穩定性和揮發性,改善分離效果和適用於特殊的檢測器。用高效液相色譜柱前衍生化分離測定手性異構體藥物,則需在待測物中引入手性拆分基團。

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