臨床生物化學/基因工程的常用工具
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（一）載體
載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質體（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質體（粘粒）、病毒等。載體具有能自我複製；有可選擇的，便於篩選、鑒定的遺傳標記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特徵。
質體存在於多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質結合。質體有嚴緊型和鬆弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ複製，一個細胞可複製1-5個質體。而鬆弛型由DNA多聚酶Ⅰ複製，一個細胞可複製30-50個質體，如果用氯黴素可阻止蛋白質合成，使質體有效利用原料，複製更多的質體。質體經過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質體都含有多個基本基因，如複製起動區（複製原點Ori），便於複製擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青黴素Apr、抗四環素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便於基因重組體的篩選；基因發動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉錄終止序列，便於插入的外源基因轉錄、翻譯表達。質體上還有許多限制性內切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點。
常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統；雙鏈噬菌體系統。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點，便於選擇，靈活應用。
（二）工具酶
工具酶是基因重組技術不可缺少的工具。主要有限制性內切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉錄酶、核酸酶等。
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，並在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉對稱。切口分開端和粘端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩衝液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。
| 酶 | 識別序列 | 切口 | |
| Alu Ⅰ | …AGCT… | …AG CT… | 四核苷酸 |
| …TCGA… | …TC GA… | 平端切口 | |
| Eco R1 | …GAATTC… | …G AATTC… | 六核苷酸 |
| …CTTAAG… | …CTTAA G… | 粘端切口 |
連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發現外，發現大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性）。
大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性。可用於缺口翻譯（Nick translation）法標記核酸，也可用於DNA序列測定，修補DNA鏈等。
核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用於切去ds-cDNA合成中產生的髮夾環。
末端轉移酶在Mg2+存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA為引子加成核苷酸，在Co2+存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA為引子加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用於核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾（連接器）。
鹼性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用鹼性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過複製修復另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖18-1）。
圖18-1 經鹼性磷酸酶處理後載體DNA與目的基因DNA的連接
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