臨床生物化學/基因庫的建立

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臨床生物化學

診斷分子生物學基本技術
- 分子生物學實驗基礎
  - 基因工程的常用工具
  - 目的基因
  - 基因庫的建立
  - 核酸的分離與純化
  - 探針製備

建立基因庫的目的是為了便於目的基因的保存、擴增和純化。基因庫是利用工具酶，通過基因重組技術和轉化、篩選而建立，也是基因克隆的過程。實際上是利用低等生物如細菌、病毒、噬菌體等生長快，繁殖力強的特點，而作為一種核酸擴增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組於其中，經篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便於保存，取用方便的基因庫。基因庫交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。

（一）基因重組

基因重組方案很多，簡單的可用同一種限制性內切酶分別在載體和目的基因切出相對應的切口，便於連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實驗室普遍採用，該方法可得到全長的cDNA。

（二）轉化

轉化目的是把有複製能力，但在細胞外無複製活性的目的基因-載體重組體裝入細胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細胞內複製、擴增。實驗步驟介紹如下：

基因重組方案之一

圖18-3　基因重組方案之一

⒈大腸埃希菌的處理（增加細胞膜通透性，便於基因進入細胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種於Lb agar培養基，37℃培養一晚。挑選3~5個大菌落，接種於50ml LB培養基，37℃，振搖培養一晚後，在A₅₅₀測定，要求細菌繁殖一定量（一般為細菌對數生長期），野生型（rec＋，5x10⁷cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x10⁷cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl₂懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl₂懸浮。4℃可保存48小時，用於轉化，稱competent cells。

⒉質體（如經基因重組建立的重組質體，基因庫等）的轉化將competent cells（以美國BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時將Falcon2059（傳熱係數穩定）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）於2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質體加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。並將SOC培養基置42℃備用。將試管置於42℃，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質體導入菌體。加42℃SOC培養基0.9ml於試管，37℃培養1小時。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200μlSOC培養基懸浮菌體。接種於LB-氨芐青黴素（100U/ml）培養皿，37℃培養一晚。已轉化的菌體可形成菌落（因質體上有抗氨芐青黴素基因）。在了解目的基因或其產物的基礎上對菌落進行鑒定。並在LB培養液中擴大培養。基因庫的建立、轉化、篩選、擴增、純化的過程就是基因克隆的過程。

LB培養基（1L）：10g蛋白腖，5g酵母膏，10gNaCl，高壓滅菌，pH7.5。

SOB培養基（1L）：20g蛋白腖，5g酵母膏，0.5gNaCl，高壓滅菌。另外準備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加1ml於100ml培養基。

SOC培養基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。