生物化學與分子生物學/工具酶

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生物化學與分子生物學

DNA重組與基因工程

DNA重組技術中對核酸的「精雕細刻」主要用酶作為工具。分子生物學研究過程中發現的酶，許多都用作工具，表20-列出最常用的幾種工具酶。限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）在重組DNA技術中有重要地位，在此較詳細介紹。

一、限制性核酸內切酶的概念

核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個接一個把核苷酸水解下來；核酸內切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3』，5』磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細菌和細胞中都能識別外來的核酸並將其分解，1962年發現這是因為細菌中含有特異的核酸內切酶,能識別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見的是甲基化酶,能使細胞自身核酸特定的序列上鹼基甲基化,從而避免受內切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會被細胞的核酸酶所水解.這樣細胞就構成了限制一修飾體系,其功能就是保護自身的DNA,分解外來的DNA,以保護和維持自身遺傳信息的穩定,這對細菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內切酶名稱中「限制」二字概念的由來。

二、限制性核酸內切酶的命名

按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個字母與種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個字母，其後再按發現的先後寫上羅馬數字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先後分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。

三、限制性核酸內切酶的分類

按限制酶的組成、與修飾酶活性關係，切斷核酸的情況不同，分為三類：

Ⅰ類限制性核酸內切酶　由3種不同亞基構成，兼具有修飾酶活性和依賴於ATP的限制性內切酶活性，它能識別和結合於特定的DNA序列位點，去隨機切斷在識別位點以外的DNA序列，通常在識別位點周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。

Ⅱ類限制性核酸內切酶與Ⅰ類酶相似，是多亞蛋白質，既有內切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點在識別序列周圍25-30bp範圍內，酶促反應除Mg2+外，也需要ATP供給能量。

Ⅲ類限制性核酸內切酶　只由一條肽鏈構成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強，且就在識別位點範圍內切斷DNA。是分子生物學中應用最廣的限制性內切酶。通常在重組DNA技術提到的限制性核酸內切酶主要指Ⅱ類酶而言。

表20-1 DNA重組技術中最常用的工具酶

酶	主要用途
限制性核酸內切酶	識別DNA特定序列，切斷DNA鏈
DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）	①缺口平移製作標記DNA探針 ②合成cDNA的第二鏈 ③填補雙鏈DNA3』凹端 ④DNA序列分析
耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）	聚合酶鏈反應（PCR）
DNA連接酶	連接兩個DNA分子或片段
多核苷酸激酶	催化多核苷酸5』羥基末端磷酸化，製備末端標記探針
末端轉移酶	在3』末端加入同質多聚物尾
SI核酸酶，綠豆核酸酶	降解單鏈DNA或RNA，使雙鏈DNA突出端變為平端
DNA端酶Ⅰ	降解DNA，在雙鏈DNA上產生隨機切口
RNA酶A	降解除RNA
磷酸酶	切除核酸末端磷酸基

四、限制性核酸內切酶的作用

大部分限制性核酸內切酶識別DNA序列具有迴文結構特徵，切斷的雙鏈DNA都產生5』磷酸基和3』羥基末端。不同限制性核酸內切酶識別和切割的特異性不同，結果有三種不同的情況：

①產生3』突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 為例：

5』…G↓AATT C…3』→5』…Gp　OHTTAAC…3』

3』…C ATAA↑G…5』EooP Ⅰ 3'…　 CTTAAOH　 pG…5'

②產生5』突出的粘性末端：以PstⅠ為例：

5』…CTGCA↓G…3』→5』…CTGCAp　OHG…3』

3』…G↑ACGTC…5』PstⅠ 3』…GOH　pACGTC…5

③產生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ為例：

5』…TCG↓CGA…3』→5』…TCGp OHCGA…3』

3』…AGC↑GCT…5』Nru Ⅰ3』…AGCOhpGCT…5』

不同有限制性核酸內切酶識別的DNA序列可以不相同。有的識別四核苷酸序列，有的識別六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是隨機排列的，則一個識別四核苷酸序列的內切酶平均每隔256bp出現一次該酶的識別切割位點，同樣的對識別六或八核苷酸序列的內切酶則大致上分別是每隔4kb或65kb出現一次識別切割位點。按此可大致估計一個未知的DNA分子限制性內切酶可能具有切點頻率，以便選用合適的內切酶。

限制性核酸內切酶的種類很多，至今已發現近800多種，可以根據它們對DNA有不同的識別序列和切割特徵選用，從而為基因工程提供了有力的工具。表20-2列出了幾種最常用的限制性核酸內切酶的識別序列和切割點。

表20－2　幾種最常用的限制性核酸內切酶

限制性核酸內切酶名稱	識別序列和切割點
BamHⅠ Cla Ⅰ EooR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ	G↓GATCc AT↓CGAT G↓AATTC A↓AGCTT GTPy↓PuAC GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G G↓TCGAC ↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG