生物化學與分子生物學/基因序列導入細胞

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生物化學與分子生物學

DNA重組與基因工程

目的基因序列與載體連接後，要導入細胞中才能繁殖擴增，再經過篩選，才能獲得重組DNA 分子克隆，不同的載體在不同的宿主細胞中繁殖，導入細胞的方法也不相同。

一、轉化

由於外源DNA的進入而使細胞遺傳性改變稱為轉化，早在1943年，Avery等就發現有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養後產生有毒性的肺炎雙球菌後代的轉化現象。但DNA進入細胞的效率很低，在分子生物學和基因工程工作中可採取一些方法處理細胞，經處理後的細胞就容易接受外界DNA，稱為感受態細胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉化效率。例如大腸桿菌經冰冷CaCl2的處理，就成為感受態細菌，當加入重組質體並突然由4℃轉入42℃作短時間處理，質體DNA就能進入細菌；用高電壓脈衝短暫作用於細菌也能顯著提高轉化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉化法。

二、感染

噬菌體進入宿主細菌，病毒進入宿主細胞中繁殖就是感染（infection）。用經人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組後，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進入宿主細菌或細胞，使目的序列得以複製繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。

三、轉染

重組的噬菌體DNA也可象質體DNA的方式進入宿主菌，即宿主菌先經過CaCl2，電穿孔等處理成感受態細菌再接受DNA，進入感受態細菌的噬菌體DNA可以同樣複製和繁殖，這種方式稱為轉染（transfection）。M13噬菌體DNA導入大腸桿菌就常用轉染的方法。重組DNA進入宿主細胞也常用轉染方式。最經典的是1973年建立的磷酸鈣法，其利用的基本現象是：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉澱物形式出現時，培養細胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養的哺乳類細胞也能提高細胞攝取DNA能力，但所用外加電場的強度、電脈衝的長度等條件與處理細菌者都很不相同。近年來用人工脂質膜包裹DNA，形成的脂質體（Liposome）可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞，方法簡單而有效，現有商售的脂質體試劑，使用日益廣泛。