生物化學與分子生物學/目的基因序列克隆的篩選與鑒定
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目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的，因而最後生長繁殖出來的細胞並不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最後培養出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等於獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術的基本原理加以介紹。
目錄 |
一、根據重組載體的標誌作篩選
最常見的載體攜帶的標誌是抗藥性標誌，如抗氨芐青黴素（anpr）、抗四環素(terr)、抗卡那黴素(kanr)等。當培養基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個抗藥性標誌就會消失。例如質體pBR322含有anpr、和terr兩個抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青黴素或四環素培養基中，凡未接受質體DNA的細胞都不能生長；凡在含氨芐青黴素和四環素中都能生長的細菌是含有質體pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青黴素中能生長、而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質體。
載體含有lacZ』的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質體pUC19的多克隆位點，轉化大腸桿菌，放入含氨芐青黴素、IPTG、X-gal的培養基中培養，凡能生長並呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質體，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。
根據重組載體的標誌來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發生變異而引起抗藥性的改變，卻並不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細緻的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉化後生長的菌落複印到硝酸纖維膜上，用鹼裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質標記，通常是經顏色呈現指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術的出現給克隆的篩選增加了一個手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引子，以轉化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產物，則該轉化細胞就可能含有目的的序列。
四、免疫學方
利用特定抗體與目的基因表達產物特異性結合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產物的反應指示含有目的基因的轉化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞後能夠表達出其編碼產物。抗體可用特定的酶常用過氧化物酶、鹼性磷酸酶等標記，結合酶標抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現顏色，從而指示出含有目的的基因的細胞集落位置。免疫學方法特異性強、靈敏度高，適用於從大量轉化細胞集合體中篩選很少幾個含目的基因的細胞克隆。
五、DNA限制性內切酶圖譜分析
這是在上述篩選後的進一步分析。目的序列插入載體會使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map）發生變化，例如一個長600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切後的粘末端連接插入pUC19的多克隆點，則重組質體就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切後會出現600bp和-2.7kb兩個DNA片段，提取轉化細菌的質體DNA作酶切後做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結果；如插入的目的序列中有其它限制性內切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測定來最後鑒定。已知序列的核酸克隆要經序列測定確證所獲得的克隆準確無誤；未知序列的核酸克隆要測定序列才能確知其結構、推測其功能，用進一步的研究。因此核酸序列測定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。核酸序列測定的原理和方法在實驗教材中有詳細的敘述。
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