基因診斷與性病/淋病實驗室檢查
| 醫學電子書 >> 《基因診斷與性傳播疾病》 >> 淋病 >> 淋病臨床表現 >> 淋病實驗室檢查 |
| 基因診斷與性傳播疾病 |
|
|
淋球菌實驗室檢查包括塗片，培養檢查淋球菌、抗原檢測，藥敏試驗及PPNG測定，基因診斷。
（一）塗片檢查：
取患者尿道分泌物或宮頸分泌物，作革蘭氏染色，在多形核白細胞內找到革蘭氏陰性
雙球菌。塗片對有大量膿性分泌物的單純淋菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90%左右，可以初步診斷。女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，陽性率僅為50-60%，且有假陽性，因此世界衛生組織推薦用培養法檢查女病人。慢性淋病由於分泌物中淋球菌較少，陽性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高檢出率。
咽部塗片發現革蘭氏陰性雙球菌不能診斷淋病，因為其他奈瑟菌屬在咽部是正常的菌群。另外對症状不典型的塗片陽性應作進一步檢查。
（二）培養檢查：
淋球菌培養是診斷的重要佐證，培養法對症状很輕或無症状的男性、女性病人都是較敏感的方法，只要培養陽性就可確診，在基因診斷問世以前，培養是世界衛生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。目前國外推薦選擇培養基有改良的Thayer-Martin（TM）培養基和New York City（NYC）培養基。國內採用巧克力瓊脂或血瓊脂培養基，均含有抗生素，可選擇地抑制許多其他細菌生長。在36℃，70%濕度，含5%-10%CO2（燭缸）環境中培養，24-48小時觀察結果。培養後還需進行菌落形態，革蘭氏染色，氧化酶試驗和糖發酵試驗等鑒定。培養陽性率男性80%-95%，女性80-90%。
（三）抗原檢測
1．固相酶免疫試驗（EIA）：可用來檢測臨床標本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地區而又不能作培養或標本需長時間遠送時使用，可以在婦女人群中用來診斷淋球菌感染。
2．直接免疫熒光試驗：通過檢測淋球菌外膜蛋白I的單株抗體作直接免
疫熒光試驗。但目前在男女二性標本的敏感不高，特異性差，加之實驗人員的判斷水平，故該實驗尚不能推薦用來診斷淋球菌感染。
（四）基因診斷
1．淋球菌的基因探針診斷
淋球菌的基因探針診斷，所用的探針有：質體DNA探針，染色體基因探針和rRNA基因探針。
（1）質體DNA探針
① 隱蔽質體DNA探針，淋球菌質體分為三種：接合性質體，分子最大，為36kb DNA； 耐藥性質體包括兩個質體，DNA長分別為5.6kb和7.1kb；隱蔽質體4.2kb。其中隱蔽質體存在於96%的臨床淋球菌分離株中，其它奈瑟菌不含有此質體，故可用它的序列作為特異DNA探針檢測淋球菌。Torres採用核酸雜交技術檢測淋球菌，所用探針為隱蔽質體。用該探針對134株淋球菌和131株相關菌株的檢測，有124株淋球菌雜交反應陽性，佔93%，還可與個別其它的奈瑟菌出現交叉反應，對測定探針的敏感性實驗表明可檢出102CFU淋球菌。研究證明隱蔽質體中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色體中（包括不含該質體的菌株）。因此CPPB基因探針具有良好的特異性和敏感性。Torres等用CPPB基因探針檢測了201份臨床標本，採用非放射性地高辛標記系統，其敏感性和特異性分別為95%和98%。
② 耐藥性質體DNA探針
淋球菌的抗藥質體可分為：①產青毒素酶淋球菌（PPNG）其β-內醯胺酶陽性；②具有高水平的質體介導的耐四環素淋球菌（TRNG）。
PPNG菌株是1976年首次在實驗室分離得到的，該菌中含有編碼產青毒酶的基因，該基因既可整合於染色體上也可出現在質體DNA中，而後者居多，稱之為產青毒素酶質體，質體有二種，大小分別為7.4kb和5.3kb。Pescador1998年設計一特異的檢測淋球菌編碼β-內醯胺酶基因的探針，採用酶化學發光法標記，液相雜交，用測光計測是特異雜交體的光量。在4h內可檢測104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株雖對四環素耐藥，但通常對β-內醯胺酶類及喹諾酮類抗菌素敏感。因此，在實驗室藥敏檢測中可歸為敏感細菌。Pescador用抗四環素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探針,該基因介導抗四環素,用酶化學發游標記,液相雜交,4h內可直接從臨床標本中檢出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。
(2)染色體探針
染色體探針包括已知功能的基因探針，如菌毛DNA探針和paI基因探針，這些基因在淋球菌感染人細胞的過程中起著重要作用；未知功能的基因探針，這些探針序列與染色體的特定序列互補，但目前還不知這些基因序列的功能。以上兩種染色體探針由於在淋球菌中互補序列的拷貝數較低，檢測靈敏度較低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。
（3）rRNA基因探針
rRNA基因探針是將與rRNA互補的DNA作為探針，該探針的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探針的特點是：①可以增加探針檢測的靈敏度，rRNA基因探針可同時檢測rRNA分子和DNA分子；②rRNA具有進化上的保守性；③雜交方法簡便、快速；④由於rRNA的含量較高，標本不需增菌。美國Gen-Probe公司生產的淋球菌檢測探針PACe C，是以rRNA 及其基因為檢測靶序列，採用放射性標記，在2h內可以完成檢測，Peter用這種探針檢測395個臨床標本，結果靈敏度和特異性分別為92.9%，99.4%，他認為PACeC系統篩查臨床標本中淋球菌是一個可靠的方法。該探針還可以檢測無症状淋球菌感染者，這是目前培養難於達到的。
2、淋球菌的基因擴增檢測
上面講述的探針技術檢測淋球菌的方法，雖然比培養方法在靈敏度，特異性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多數情況下需要標本的淋球菌濃度很高，PCR技術和連接酶鏈反應的出現進一步提高了檢測淋球菌的靈敏性，它具有快速、靈敏、特異、簡便的優點，可以直接檢測臨床標本中極微量的病原體。
（1）淋球菌DNA的提取
①培養菌的DNA提取
將培養得到的淋球菌，以102cfu/ml的濃度溶於鹼性裂解液中裂解，裂解液組成為：1m NaCl 1MNaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。將裂解液混勻後煮沸1min，然後用100μl 的1MTris pH7.0中和鹼性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然後用無水乙醇或異丙醇沉澱DNA，提取的DNA溶於30μl蒸餾水或TE緩衝液中。
②臨床棉拭子標本的提取
將貼有分泌物的棉拭子在2ml的無菌生理鹽水中或PBS緩衝液中擠壓洗1min，以便將標本盡量溶於溶液中，將棉拭子棄去，懸浮液於2-3000r/min離心5min，吸去上清液，細胞重新溶於100μl 1×PCR緩衝液，其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml，細胞懸浮液於50-60℃溫浴1h,然後95℃加熱10min以滅活蛋白酶K,12000r/min離心10min,上清液含DNA模板。
（2）PCR引子的設計
由於淋球菌隱蔽質體CPPB基因在淋球菌染色體中和4.2kb隱蔽質體中都有存在，同時在96%的淋球菌中都有該隱蔽質體，因此很多PCR引子設計在CPPB基因區。
靶基因 引子序列 片段長度（bp）
CPPB NG1 5′GTT TGG CTGGTT GAT TCA AG 3′633
NG2 5′GCA AGA TTTCCG ATTT GGC G 3′
CPPB HO15′GCT ACG CATACC CGC GTT GC 3′ 390
HO2 5′CGA AGA CCTTCG AGC AGA CA 3′
rRNA引子15′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′ 206
引子2 5′-ACA CTC GAGTCA CCC AGT TC-3′
CPPB GC15′CTT ATC GTTTGG CTG GTT GAT TC 3′ 435
GC2 5′ACC AAG ACCAAA GGT TTG ACA CTG 3′
GC3 5′ATT TTC CAGTGT CAA AC 3′ 241
GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′
（3）PCR擴增
取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反應液中，最終PCR反應液中含dNTP各100μmol/L，引子各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L,加無菌石蠟油30μl，1000r/min離心30s，進行PCR擴增循環，反應條件：94℃變性1min，然後94℃30s，57℃1min，72℃1min。共30個循環，最後72℃延伸5min。
擴增產物於2%的瓊脂糖凝膠電泳30min，溴化乙錠染色，紫外燈下可見擴增的DNA熒光條帶，分子大小應與所用引子擴增靶序列的大小一致。
（4）PCR的靈敏性和特異性
由於CPPB在不含有隱蔽質體的淋球菌染色體上也會含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都會有隱蔽質體，因此用CPPB作為靶序列的引子具有極高的敏靈性，實驗證明，一般傳統一步PCR（GC1-GC2）方法可以檢出3個淋球菌，而用單管巢式PCR（GC2-GC4）可以檢出≤0.3淋球菌（9個CPPB基因）。這些引子經特異性實驗，只能擴增淋球菌的DNA，而對非淋球菌奈瑟氏菌擴增不出特異產物。
（5）單管巢式PCR方法
是在傳統巢式PCR的基礎上將兩對PCR引子作特殊的設計，巢式外側兩個引子（GC1，GC2）為25b退火溫度比較高（68℃），巢式內側兩個引子GC3-GC4為17b退火溫度較低（46℃），PCR反應液的其它成分與一般PCR相同。這樣，通過控制退火溫度（68℃）使外側引子先行擴增，經過20-30次循環後（第一次PCR），再降低退火溫度（46℃）使內側引子以第一次PCR產物為模板進行巢式擴增，該PCR的靈敏度可達到檢出0.3個淋球菌。
（6）淋球菌連接酶鏈反應（LCP）檢測方法
目前PCR檢測淋球菌的方法被廣泛地使用。其特異性，靈敏性不斷提高。同時另一種基因診斷技術——連接酶鏈反應（LCP）也以其高特異，高靈敏性被應用於淋球菌的檢測中。LCp 與PCR不同之處在於LCp 用四對引子，所用酶是連接酶。連接酶可以將兩條相鄰引子連接起來。連接起來的兩條引子可以作為另兩條引子的模板，後者在連接酶作用下連接，又可作為模板，如此進行30-40次循環。LCP所用的模板處理方法與PCR模板製備相等。LCP所用的探針除了可以設計在CPPB基因上，也可以設計在染色體基因序列上，例如opa-1基因。美國Abbott實驗室在opa-1基因的48bp長的區域內設計了4個LCP探針，由於opa-1基因在淋球菌的染色體中有11次重複。因此，該組LCP探針具有高靈敏性和特異性。LCP反應過程：
將模板加入LCP反應液中，LCP反應液：20mmol/L Tris-HClpH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EDTA; 10mmol/L NAD+;10mmol/L DTT,有標記物的兩個相鄰探針各40fmol/L，未標記的探針各40fmol/L，15U耐熱連接酶，反應條件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循環。100μl反應產物加入酶標板微孔中，進行顯色反應，最後用酶標儀讀取光值。根據Buimer的實驗證明，LCP在檢測男性尿道棉拭子標本的靈敏度為100%，尿液標本為88.9%，女性宮頸棉拭子標本為95.4%。LCP方法的特異性高達100%，這一點明顯高於PCR的特異性，避免了假陽性的發生。
3． 臨床基因診斷淋球菌的注意事項
目前臨床檢測淋球菌的基因診斷方法主要採用PCR方法，但是該方法在臨床檢測中應注意幾個問題。
（1）引子設計 除了以上所列的淋球菌PCR引子外，還可從在其它基因上設計，但
是引子序列應具有特異性。因為細菌的染色體較大，許多基因序列並沒有搞清楚；同時細菌之間或近或遠有一定的同源性，而且細菌所含質體序列間也存在同源性，因此設計引子一定要進行基因資料庫比較分析，同時進行特異性和靈敏性實驗，從中選擇引子進行臨床檢測。
（2）臨床標本處理 對臨床標本來講，PCR模板要求越純越好。這就要求在採集標本時要取到準確的位置，對於無症状患者要適當多採樣，以保證採集到病原體細菌。另外由於臨床標本成分比較複雜，有時簡單處理的標本PCR擴增效果並不理想，這可能是由於雜質過多造成的,需要進一步純化，如用酚一氯仿抽提法純化，結果將會好轉。這種純化方法比較麻煩,目前已有商品化的DNA純化試劑盒,可以較簡便地從臨床標本中提取高純度的DNA。
（3）PCR產物的檢測方法 不久以前臨床PCR檢測淋球菌幾乎都採用電泳的方法進行PCR產物的鑒定。該方法存在許多問題，如由於肉眼觀察的主觀性而造成假陽性和假陰性的結果。目前用雜交顯色法代替電泳法，提高了結果判斷的特異性和靈敏性。
總之，PCR方法與LCP方法比傳統的培養法在靈敏性和特異性上有了很大的提高，時間也大大縮短。隨著基因診斷技術的不斷改進。PCR方法與LCP方法在淋球菌的檢測將會成為常規的檢測方法。
（五）藥敏試驗：在培養陽性後進一步作藥敏試驗。用紙片擴散法做敏感試驗，或用瓊脂平皿稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），用以指導選用抗生素。
（六）PPNG檢測：β-內醯胺酶，用紙片酸度定量法，使用Whatman I號濾紙PP-NG
菌株能使其顏色由藍變黃，陽性為PPNG，陰性為N-PPNG。
 淋病對妊娠及新生兒的影響 | 淋病診斷與鑒別診斷  |
| 關於「基因診斷與性病/淋病實驗室檢查」的留言： |  訂閱討論RSS
|
|
目前暫無留言 | |
| 添加留言 | |