基礎檢驗學/血細胞分析儀應用進展

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臨床基礎檢驗學

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隨著高技術的引用和基礎醫學的發展,各種類型的血液分析儀相繼問世。其進展主要表現在以下幾方面:

(一)儀器測試原理的改進

這些儀器主要體現在白細胞分類部分的改進,即電阻抗法的三分群發展為多項技術聯合同時檢測一個細胞,綜合分格實驗數據,得出的較為準確的白細胞分群結果。迄今,世界上應用的這類儀器主要有以下四種類型。

1.容量、電導、光散射(VCS)白細胞分類法VCS(volume conductivity lightscantter)技術可使血細胞在未經任何處理,與體內形態完全相同的自然狀態下得出檢測結果。首先在標本內中入只作用於紅細胞溶血劑使紅細胞溶解,然後加入抗溶血劑,起中和前述溶血劑的作用,使白細胞表面、胞質及細胞大小等特徵仍然保持與體內時間相同的狀態。

根據流體力學的原理使用鞘流技術使溶血後液體內剩餘的白細胞單個通過檢測器,VCS三種技術的同時檢測,體積的測量使用的是電阻抗原理。電導性是根據細胞壁能產生高頻電流的性能,採用高頻電磁探針測量細胞內部結構 — 細胞核細胞質的比例,細胞骨的化學成分,以此來幫助鑒別細胞。因此電導性可辨別體積完全相同的而性質量同的兩個細胞群。如小淋巴細胞嗜酸性粒細胞兩者直徑均為9-12μm,當前高頻電流通過這兩種細胞時,由於他們的核與胞質比例不同,而呈現出不同的信號,藉此可把他們區分開來,光散射(scatter,S)是除了體積和電導性以外,又從細胞表面光散射的特點提供細胞類型的鑒別方式,來自雷射光源的單色光束直接進入計數池的敏感區,在100-700時對每一個細胞進行掃描分析,提供細胞結構、形態的光散射信息。光散射特別具有對細胞顆粒的構型顆粒質量的區別能力。細胞粗顆粒挑散射要雙細顆粒更強,所以通過光散射可幫助儀器將粒細胞分開。

根據以上三種方法檢測的數據,經計算機處理得出細胞分布圖(圖示-15)進而計算出實驗結果。圖中各圈內的範圍均代表正常細胞和異常細胞在圖中可能出現的位置,數字代表細胞的類型。

VCS法細胞分布圖


圖2-15 VCS法細胞分布圖

1.幼稚細胞 2.桿狀核粒細胞

3.單核細胞 4.單核細胞或淋巴細胞

5.淋巴細胞 6.變異淋巴細胞

7.小型非典型淋巴細胞 8.有核紅細胞

9.巨大血小板 10.血小板凝塊

2.阻抗與射頻技術聯合的白細胞分類法這尖儀器白細胞計數通過四個不同檢測系統完成。

(1)嗜酸性粒細胞檢測系統:血液進入儀器後,經分血器使血液與嗜酸性粒細胞特異計數的溶血的劑混合,由於其特殊的PH,使除嗜酸性粒細胞以外的所有細胞溶解萎縮,含有完整的嗜酸性粒細胞液體的通過小孔時,使計數電路產生脈衝而被子計數。

(2)嗜三性粒細胞檢測系統:計數原理與嗜酸性粒細胞相同,由於鹼性溶血劑只能保留與血液中嗜鹼性的粒細胞,因此根據脈衝的多少即可求得嗜鹼性粒細胞數。上述二種方法除需要使用專一的溶血劑外,還需特定的作用溫度和時間。

(3)淋巴、單核、粒細胞(中性、嗜鹼性、嗜酸性性)的檢測系統:這個系統採用電阻與射頻聯合檢測的方式。使用的溶血劑的作用較輕溶血劑穿透細胞膜時僅使少量的胞質溢出,對核的皺縮作用也較輕微,細胞形態改變不大。在小孔的內外電級上存有直流和高頻兩個放射器,在小孔周圍存在直流電及射頻兩小及顆粒的多少。因此細胞進入小孔時產生兩個不同的脈衝信號,脈站的高低分別代表細胞的大小和核及顆粒的密度,以DC信號為橫叢標,RF為縱坐標,就可根據2個信號把同一個細胞定位於二維的細胞散射圖上。由於淋巴細胞、單核細胞及粒細胞的細胞大小、細胞質含量,胞質內顆粒的大小與密度、細胞核的形態與密度不同,DC及EF的脈衝信號有較大的差異,定位在各自散射的區域,通過掃描技術得出各類細胞比例(見圖2-16)。

電阻抗與射頻聯合檢測白細胞分布圖


圖2-16 電阻抗與射頻聯合檢測白細胞分布圖

(4)幼稚細胞檢測系統:此胞膜脂質較成熟細胞少的現象,在細胞懸液加入硫化胺基酸後,由於細胞上脂質佔位不同,故結合在幼稚細胞的硫化胺基酸較成熟的細胞多,且對溶血劑有抵抗作用。當加入溶血劑後,成熟細胞被溶解,如果懸液中存在細胞細胞,其形態不受契約壞,因此可通過電阻抗的方法檢測出來。(圖2-17)。

電阻抗與射頻聯合檢測白細胞、幼稚細胞、螢幕細胞分布圖


圖2-17電阻抗與射頻聯合檢測白細胞、幼稚細胞、螢幕細胞分布圖

3.光散射與細胞化學技術聯合應用於白細胞分類計數:聯合應用雷射射的過氧化物酶染色技術來進行白細胞分類計數。嗜酸性粒細胞有很強的過氧化物酶活性,中性粒細胞有較強的過氧化物酶活性,單細胞資助之,而淋巴細胞和嗜鹼性粒細胞均無此酶。將血興高采烈經過氧化物酶染色後,胞質內即可出現不同的酶化學反應,由此構成了此種血液分析儀的分析基礎,化妝品的分血器將血加入到含有清洗劑和甲醛高滲液體內(21倍稀釋)並孵育(400~700)20秒鐘。其中清洗劑(含有非離子表面活性劑)使細胞破壞,甲醛使白細胞質內酶被固定,此後發生第二步反應,即加入過氧化氫和4氯=蔡酚,並加熱13秒,此時如果待測細胞質中含有過氧化酶即可分解H2O2產生[O],後者可使4氯-蔡酚顯色並沉積定位於酶反應部位,此類細胞通過測試區時,由於酶反應強度不同(陰性、弱陽性、強陽性)和細胞體大小不同,雷射束射互細胞上的前向角和散射角有所不同,以X軸為吸光率標記(酶反應強度),Y軸為光散射(細胞大小)。每個細胞產生的兩個信號結合定位在細胞圖上(圖2-18)。每秒鐘儀器可測上千個細胞。計算機系統對存儲的資料進行分析處理,並結合嗜好鹼性粒細胞或分葉核粒細胞通道結果計算出白細胞總參數和分類良數。

雷射與細胞化學聯合檢測白細胞直方示意圖


圖2-18 雷射與細胞化學聯合檢測白細胞直方示意圖

4.多角度偏振光散射白細胞分類技術(multi — Angle polatised scatter separation of white cell,MAPSS)其原理是一定體積的全血標本用鞘流液按適當比例稀釋。其白細胞內部結構近似於自然狀態,因嗜鹼性粒細胞嘌粒具有吸濕的特性,所以嗜鹼性粒細胞的結構有輕微改變。紅細胞內部的滲透透壓高於鞘興高采烈的滲透壓而發生改變,紅細胞內的血紅蛋白從細胞內游離出來,而鞘液內的水分進入紅細胞中,細胞膜的結構仍然完整,但此時的紅細胞折炮指數與鞘液的相同,故紅細胞不干擾白細胞檢測。

在水動力系統的作用下,樣本被集中為一個直徑為30μm的小股液流,該液流將稀釋細胞單個排列,因是單個通過雷射束,故在各個方向都有其散射光。可以從四個角度測定散射光的密度(見圖2-19):①00前角光散射(10~30)粗略地測定細胞大小;②100:狹角光散射(70~110)測細胞結構及其複雜性的相對特徵;③900:900消偏振光散射(700`~1100),基於顆粒可以將垂直角度的偏振雷射消偏振的特性,將嗜酸細胞從中性粒細胞和其它細胞中分離出來。④900:垂直光散射(700~1100)主要對細胞內部顆粒和細胞成分進行測量。可以從這四個角度同時對個白細胞進行測量,同一種特定的程序自動儲存和分析數據,將白細胞分為嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞5種。

MAPSS測量原理


圖2-19 MAPSS測量原理

(二)儀器自動化水平的提高

80年代以前,血細胞分析主動脈要是半自動型。此類儀器需要將標本經機外預稀釋後才能檢測,惚受干擾,隨機誤差也很大。隨著全自動型儀器不斷湧現,血液直接被入血細胞分析儀後的在機內自動稀釋、自動加溶血劑、定時檢測,提高了儀器的精確度和準確度。

最近,「聯合型血液分析系統『問世,這個系統將先進的血細胞分析儀、塗片機、染色下、網織紅細胞儀串聯在一起。血液先經血細胞分析儀檢測,根據紅細胞情況決定是否做網織紅計數;根據HCT來改變推片機的角度和速度,以保證血塗片的合格。根據實驗數據和直方圖的變化,計算機選擇是否需要一步顯微鏡檢查。特別是自動加樣系統和真空采血管的應用。不但可能避免實驗的隨機誤差,提高工作效率,而且可避免某些實驗環節造成的血行感染,對工作人員的勞動保護起以關鍵作用,成為儀器發展和使用的潮流。

(三)各種特殊技術的應用

為了保證實驗結果的準確,不同儀器使用不同的特殊技術:①為了使細胞計數準確採用「三次計數「表決;②採用熱敏電阻裝置,監測試劑溫度;③為了使積壓小板計數準確,採用流技術及鞘流;④為同避免小細胞和大血小板干擾血小板計數,採用浮動界標技術;⑤儀器自動保護技術、採用了燃燒電路、管道和過樣針的自動清洗及故障礙自檢功能;⑥各種方式的質控制資料儲存和處理(比如X-B質控法)。這些技術對於質量控制起了關鍵作用。

以上介紹了近年來五分類法血細胞分儀白細胞分類的原理及臨床應用價值。不難看出,由於高科技的應用,使細胞分析更精確、更準確,為臨床診斷與治療提供了重要依據,也大大提高了實驗室工作效率。但應指出,各類儀器仍有其不足之處,如不能對單個細胞完全識別,特別是白血病細胞和正常單核細胞、異常不典型淋巴細胞,因為五分類法儀器的白細胞分類只是嚴格根據篩選標準報告實驗結果,必要時仍需以顯微鏡塗片檢查進行複檢。

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