基因文庫
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中文名稱： 基因文庫
英文名稱： gene library
學科分類： 遺傳學
注 釋： 一個生物體的基因組DNA用限制性內切酶部分酶切後，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個生物體的整個基因組，也就是構成了這個生物體的基因文庫。
將這些載體導入到受體細菌或細胞中，這樣每個細胞就包含了一個基因組DNA片段與載體重組DNA分子，經過繁殖擴增， 許多細胞一起包含了該生物全部基因組序列，我們將這一個集合體叫做基因文庫。
用重組DNA技術將某種生物細胞的總DNA 或染色體DNA的所有片斷隨機地連接到基因載體上,然後轉移到適當的宿主細胞中，通過細胞增殖而構成各個片段的無性繁殖系（克隆），在製備的克隆數目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用於某種生物的粒線體DNA或葉綠體DNA的基因文庫。由於製備DNA片段的切點是隨機的，所以每一克隆內所含的 DNA片段既可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側的鄰近DNA順序。
目錄 |
基因文庫與基因庫的區別
基因文庫與基因庫的概念不同。基因庫是指某一生物群體中的全部基因。基因文庫與基因克隆的概念也有區別，基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文庫中包含著為數眾多的克隆，建成後可供隨時選取其中任何一個基因克隆之用。
基因文庫的建立和使用是70年代早期重組DNA技術的一個發展。人們為了分離基因，特別是分離真核生物的基因，從1974年起相繼建立了大腸桿菌、酵母菌、果蠅、雞、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的粒線體和葉綠體 DNA的基因文庫。基因文庫的建立使分子遺傳學和遺傳工程的研究進入了一個新時期。
基因文庫的建立
一個基因文庫中應包含的克隆數目與該生物的基因組的大小和被克隆 DNA片段的長度有關。原核生物的基因組較小，需要的克隆數也較少；真核生物的基因組較大，克隆數需相應增加，才能包含所有的基因。此外，每一載體DNA中所允許插入的外源DNA片段的長度較大，則所需總克隆數越少；反之則所需數越多。如果一個基因文庫的總克隆數較少，則從中篩選基因雖然比較容易，但給以後的分析造成困難，因為片段的長度增加了。如果要使每一克隆中的 DNA片段縮短，就須增加克隆數，所以在建立基因文庫前應根據研究目的來確定 DNA片段的長度和克隆的數目。L.克拉克和J.卡邦在1975年提出一個統計學的公式來計算某一基因文庫中所應包含的克隆數目。在建立基因文庫時，任何一個DNA片段都是在隨機的基礎上被克隆的。在公式
中，P 是從建成的基因文庫中可能選出某一基因的機率，這一數字由工作者根據需要選定。ƒ 是該基因文庫中每一克隆所含外源 DNA片段的平均長度，可根據該生物基因組大小和所用載體可容納的外源 DNA片段的長度決定。G是該生物基因組的大小，基因組大小和DNA片段長度的單位可用道爾頓或鹼基對表示。N 是這一基因文庫所應包含的克隆數目。在製備某一哺乳動物基因文庫時,假若選出某一基因的機率定為99％,每一克隆內所含外源DNA片段的平均長度是2×104鹼基對,基因組大小是3×109鹼基對，則
基因組大小及片段等之間的關係
下表中表示基因組大小(G)、片段大小(ƒ)、出選某基因的機率(p)與總克隆數(N)四者之間的關係。
產生 DNA片段的方法要求切點隨機性高，使任一基因都可能被完整地克隆，並且最好在兩側都留有粘性末端以利於 DNA片段間的連接。機械剪切方法的優點是隨機性高，可是所得片段兩端沒有粘性末端，有時較為不便與載體連接。用限制性核酸內切酶酶解的隨機性較差，但是兩端有粘性末端,便於和載體相連接（見重組DNA技術）。
基因載體通常根據待克隆的 DNA片段長度來選擇。在製作原核生物基因文庫時，因基因組較小，可把 DNA片段切得短些，可選用質體如pBR322等作載體。真核生物的基因內部常有稱為內含子的非編碼區，使一個天然基因的長度比實際編碼的部分要長得多，基因文庫中待克隆的 DNA片段便應長些，以保證得到完整的基因。通常採用的載體有經過改建的噬菌體如λCharon4A（長度462kb，可克隆外源DNA長度 8.2～22.2kb）和粘性質體(例如pHC79，長度6.4kb,可容納外源DNA長度37～50kb)等。
經剪切得到的 DNA片段可通過噬菌體T4連接酶或大腸桿菌連接酶與載體DNA共價連接，使成為雜種DNA分子。
用質體作為載體的重組 DNA分子可以通過轉化引進細胞。用λ噬菌體的 DNA作載體的重組分子直接經轉染引入細胞的效率較低；一般需先行離體包裝，即把重組DNA分子包在噬菌體外殼中,再通過噬菌體感染而把重組DNA 分子引入敏感細菌細胞中。它的效率比轉染高出幾十到幾百倍。
基因文庫的保存
為了有效地保存基因文庫，可通過細菌的繁殖而使包含各個特定 DNA片段的細菌增多。液體培養不適用於這一目的，因為各個細菌的生存和繁殖能力不同，各個克隆被保存的機會也會因此而不相等。在固體培養基上每一個細菌單獨形成一個菌落，各個細菌並不相互干擾和競爭，因而有利於全部克隆的保存。形成的每一個菌落中大約包含107個細菌，這樣一個基因文庫中的所有的克隆幾乎都擴增了107倍。把培養皿上的細菌全部洗下加以保存，便可以在需要時從中取得任何一個克隆。
基因文庫的利用
從基因文庫中篩選某一克隆的常用辦法是分子雜交。首先把屬於一個文庫的細菌或噬菌體以較低密度接種在培養皿上以取得相當分散的菌落或噬菌斑，然後用硝酸纖維濾膜吸印，使培養皿和濾膜的相對應的位置上具有相同的克隆。同時另行製備供分子雜交用的探針。為了篩選真核生物的某種基因，常從它的轉錄產物mRNA經反向轉錄（見中心法則）合成相應的互補 DNA(cDNA)，再加入用32P標記的核苷三磷酸，用DNA多聚酶I切口移位方法製成有同位素標記的探針。把探針 DNA和硝酸纖維濾膜上的菌落或噬菌體分別進行變性處理，然後進行分子雜交。再將 X光底片覆蓋在經過處理的濾膜上以進行放射自顯影。在培養皿上找出和 X光底片上的黑點相對應的菌落或噬菌斑，這些菌落或噬菌體中便包含著所需要的基因。經過擴增便能得到大量的細菌或噬菌體，從中可以分離出所需基因的DNA片段。
基因文庫的應用
建立和使用基因文庫是分離基因，特別是分離高等真核生物基因的有效手段。如果一個哺乳動物的基因組是 3×109鹼基對，直接從細胞中提取並分離出某一特定基因的 DNA片段在技術上是很困難的。但是在基因文庫中，不同的 DNA片段都分別在不同的克隆中擴增了，只要有該基因的探針存在，則從許多克隆中篩選一個所需的克隆是一項比較簡單的工作。此外基因文庫中被克隆的 DNA都是基因組中各種隨機的順序片段，某些 DNA片段還包括基因外部的鄰近的甚至互相跨疊的序列，所以基因文庫特別有利於研究天然狀態下基因的順序組織。例如曾從人的基因文庫中分離得到含有血紅蛋白 β鏈基因的克隆，從中取得該基因的DNA並進行分析，發現人的δ和β鏈基因是連鎖的，二者之間相隔幾千個鹼基對，而且在它們內部都有兩個內含子。
基因文庫還可以應用在個體發育的研究中。例如從芽孢桿菌的正在形成芽孢的菌體中分離mRNA，並用同位素標記做成探針，用這些探針可以從芽孢桿菌的基因文庫中分離出只在芽孢形成過程中活動的基因，有助於對發育過程中基因調控進行研究。
基因文庫也可以應用在高等生物，例如人的基因定位工作中。基因文庫在生產實際中也是取得所需要的基因的一種重要方法。
基因文庫的背景
基因文庫有關技術的建立及應用雖然只有幾年歷史，但是它作為重組DNA技術應用的一個重要方面已經顯示了它在解決分子遺傳學中的理論問題和遺傳工程中的實際問題上的巨大潛力。
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