組織學/電子顯微鏡術
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1、透射電鏡術 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)是以電子束穿透樣品(組織的超薄切片),經聚合放大後,顯像於熒光屏上進行觀察和攝片的。電鏡的放大倍數的解析度比光鏡大得多,放大倍數為幾萬至幾十萬倍,解析度可達0.2nm。標本製備較光鏡的更嚴格,新鮮組織切成小塊(lmm3),用戊二醛,多聚甲醛、四氧化鋨等固定,樹脂包埋,以超薄切片機切成厚50~80nm的超薄切片,經醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬電子染色後,置於電鏡下觀察,標本在熒光屏上呈黑白反差的結構影像。被重金屬浸染呈黑色的結構,稱電子密度高(electron-dense);反之,淺染的部分稱電子密度低(electron-lucent),這種染色稱正染色(positive staining)。若被染結構著色淺淡,而其周圍部分染成黑,是稱為負染色(negative stainning)。透射電鏡的電子槍加速電壓50~100kV,電子束穿透力低,近年製成加速電壓500kV以上的超高壓電鏡,電子束穿透力很強,可觀察0.5~10μm厚的切片,可觀察細胞內骨架等的立體超微結構。應用電鏡觀察細胞化學染色標本,稱電鏡細胞化學術(electron microscope cytochemistry);電鏡觀察免疫細胞化學染色標本,稱免疫電鏡術(immunoelectron microscopy);電鏡與放射自顯影結合的方法稱電鏡放射自顯影術(electron microscopeautoradiography)。
2、掃描電鏡術 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)是用於觀察組織表面的立體結構的。組織塊經固定後,置於真空鍍膜儀內於燥,在標本表面先後噴鍍一層碳膜和合金膜,即可置於鏡下觀察。掃描電鏡的景深長,樣品表面的金屬膜可提高其導電性和圖像反差,在熒光屏上掃描成像,呈現富有立體感的表面圖像,如細胞表面的突起、微絨毛、纖毛及細胞的分泌與吞噬行為等(圖1-13)。
圖1-13大鼠分離肝巨噬細胞粘著吞噬羊紅細胞掃描電鏡像
M肝巨噬細胞,R羊紅細胞
圖1-14 冷凍蝕刻標本製備示意圖
圖1-15 細胞單位膜從中間層劈開示意圖
3、冷凍蝕刻復型術和冷凍割斷術
冷凍蝕刻復型術(tfeeze etch replica):是在透射電鏡下觀察組織或細胞斷裂面的金屬複製膜,顯示細胞微細結構的立體影像。組織塊先經甘油生理鹽水處理(防止形成冰晶)後投入液氮快速冷凍,在低溫下用鋼刀將樣品劈開,形成凹凸不平的斷裂面:-100℃真空下使斷裂面的冰晶升華,暴露不平整表面;在斷裂面上先後噴鍍一層合金膜和碳膜,用次氯酸等組織腐蝕掉;將反差的凸凹不平的金屬復型膜置於鏡下觀察(圖1-14)。此項技術尤適用研究生物膜的內部結構,如從單位膜的脂質分子疏水端劈開(圖1-15),經蝕刻鍍膜,鏡下可見質膜斷裂面復型膜結構狀態(圖1-16),其凹凸影像恰與實物相反。
圖1-16小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復型電鏡像 ×38300
MV微絨毛 E E面,P P面(白求恩醫科大學尹昕、朱秀雄教授供圖)
冷凍割斷術(freeze cracking):是將固定組織包埋在樹脂內,低溫下割斷,斷面噴鍍合金,在掃描電鏡下觀察斷面的立體構型。該技術適於研究組織內部微細結構的相互關係,如肝細胞與肝血竇和膽小管的關係,腎小體的腎小囊與血管球的關係等(圖1-17)。
圖1-17 大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體
R腎小囊外表面,G血管球,T腎小管
(白求恩醫科大學尹昕、朱秀雄教授供圖)
4、電鏡X-射線顯微分析術X-射線顯微分析術(X-ray microanalysis)是研究細胞和組織內元素的種類、分布和含量的新技術。它是利用高速電子束轟擊電鏡內生物標本的微小區域,使該區所含的元素髮射了一定波長的X-射線,通過檢測器對X-射線進行波譜或能譜分析,即可測定微區內元素的性質、含量和分布。如測定細胞內Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布變化,探討各種元素與細胞生理和病理的關係。
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