脈衝場凝膠電泳

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(PFGE,Pulsed Field Gel Electrophoresis)是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中,大的DNA分子(>10kb)移動速度接近,很難分離形成足以區分的條帶。在脈衝場凝膠電泳中,電場不斷在兩種方向(有一定夾角,而不是相反的兩個方向)變動。DNA分子帶有負電荷,會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉換後可以較快轉變移動方向,而較大的分子在凝膠中轉向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。脈衝場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。  

目錄

高分子量DNA瓊脂糖凝膠塊製備和加工

1.收集10ml全血,加入30ml細胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細胞完全溶解。

2.2000r/min離心10min,移去紅色上清液,再次用細胞裂解液洗滌細胞,然後用PBS重懸細胞。

3.稀釋單細胞懸液並取一小份用Neubauer腔計數細胞。

4.用PBS重懸細胞,以達到40μl PBS中含1百萬個細胞比例(1百萬個倍體哺乳動物大約含有基因組DNA 10μg)

5.用PBS配製2%濃度低熔點瓊脂糖溶液並保持在50℃。

6.將等體積(各1ml)細胞懸液與瓊脂糖溶液於室溫下混勻,立即倒入凝膠塊模具中。

7.靜置20min讓瓊脂糖固化,用無菌塑料杯(通常用作劃菌)將凝膠塊自模具中取出並置入蛋白酶緩衝液中,加入2mg/ml的蛋白酶K。

8.將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩衝液於50℃保持2~3天。每個盛有50ml蛋白酶緩衝液的Falcon管可容納多達100個凝膠塊。

9.蛋白酶K消化後,可將凝膠塊保留在此緩衝液或0.5mol/L EDTA溶液中保存於4℃。

10. 此外,繼續將凝膠塊用高壓消毒過的TE緩衝液沖洗數遍的步驟。

11. 將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon試管中,滅活殘留的蛋白酶K。

12. 室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數次,將凝膠塊放入另一乾淨的試管,可直接用於酶切反應或用0.5mol/L

EDTA,(pH8.0)4℃保存凝膠塊。

13. 若用EDTA保存凝膠塊,取出後應用TE溶液室溫下漂洗30 min×2次。  

大小標準物的製備

λ多聯體

1.以TE緩衝液懸浮λ多聯體(Boehringer MA寶靈曼公司產品),濃度為4μg/40μl。

2.用等體積TE配製的2%低熔點瓊脂糖(溫度保持在45℃)混勻。

3.移去混合液注入預冷的凝膠塊模具中。

4.室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天。  

酵母染色體

1.從YPD(酵母提取物,蛋白腖葡萄糖培養基瓶皿中挑選單一克隆加入10ml

YPD預培養的肉湯中,30℃下劇烈震蕩生長24小時,然後加入200ml YPD肉湯,劇烈振蕩24~48h(產量大約100塊)。

2.4000×g轉速,離心10min,然後用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。

3.仍以4000×g轉速離心10min,再用SCE[1 mol/L 山梨醇,0.1mol/L枸椽酸鈉,pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重懸。

4.取稀釋後的細胞懸液用Neubauer腔計數。

5.溶液短暫離心後,再用SCE重懸細胞,使40μl SCE溶液中含5×107個細胞(相當於80μl體積的模塊中含有5×107個細胞)。

6.溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻,37℃保溫15~30min。

7.細胞懸液與等體積的SCE配製的2%低熔點瓊脂糖凝膠混勻,保持在50℃。

8.將混合物移注入預冷的凝膠塊模具中。

9.凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1~2小時。

10. 將凝膠塊移入蛋白酶緩衝液中,加入2mg/ml蛋白酶K,50℃溫育48h。

11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次,每次min。

12. 凝膠塊可用此混合液於4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。  

瓊脂糖凝膠塊中DNA的限制性內切酶消化

1.應使用消毒溶液及戴無菌手套以免DNA降解。

2.在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min 3次,以去除EDTA。

3.混合:酶反應緩衝液(高、中或低鹽緩衝液),100

mmol/L亞精胺(只用於高鹽緩衝液狀態),10~20單位的內切酶。20單位的內切酶就足以過夜完全消化10μg DNA。

4.設立一個除內切酶成分外含有混合物各組分的陰性對照,以檢查是否有非特異性DNA降解。

5.將瓊脂糖凝膠塊加入反應混合溶液中:通常用消毒過的手術刀或套環將凝膠塊移入。

6.若兩種內切酶所需緩衝液條件一致,可以同時或先後用兩種不同的酶進行消化(先用低鹽緩衝液的酶消化,再調整鹽濃度)。倘若首次消化的酶要求50℃條件,在第二個酶消化時要換緩衝液。

7.若要進行部分消化,則首先在同一溫度和反應時間用1:10稀釋的酶進行嘗試。  

凝膠電泳

1.將0.8%的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化後冷卻至50~60℃,立即注入凝膠框架中,並插入梳子。

2.凝膠固化後小心地拔出齒梳,用2把無菌手術刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內切酶消化凝膠塊,則取不同樣品時應將手術刀片燒灼後冷卻。將DNA大小標誌物上樣至凝膠的兩旁。

3.用1%液態低熔點瓊脂糖凝膠(0.25×TBE配製)密封狹槽。

4.若有氣泡存在,用注射器驅趕氣泡。

5.一旦密封的低熔點瓊脂糖已固化(大約10min),可將凝膠擱入腔室,並用電泳緩衝液覆蓋過膠面。

6.應設定合適的電壓及轉換時間(參考《分子醫學技術》84頁表8.1)並開始電泳。兩個不同電泳方向的電流應相等。

7.電泳結束後,凝膠用0.25×TBE配製成的EB(0.4μg/ml)染色

8.用泵自槽中排除緩衝液,續以雙蒸水沖洗電泳槽。

9.凝膠成像:DNA在曝光的過程中可能會形成缺口。

10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝膠30min,讓DNA脫嘌呤,並有利於轉移。

11. 凝膠用鹼(變性溶液中)變性20min,兩次,續以中性溶液1~5min。

12. 採用標準Southern印跡方案將DNA轉印至尼龍膜上。一般來說,印跡PFGE凝膠的時間較普通凝膠印跡時間長(約48h)。

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