醫學免疫學/分子生物學技術在免疫學診斷中的應用

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醫學免疫學

免疫學檢測法
- 抗原或抗體的檢測
- 體液免疫功能的檢測
- 細胞免疫功能的檢測
- 分子生物學技術在免疫學診斷中的應用

一、BCR和TCR基因重排檢測

對血細胞惡性變如白血病、淋巴瘤等的診斷，長期以來多應用細胞形態學檢查和免疫細胞表型分析。由於這些方法在特異性和敏感性上的限制，對於丟失了細胞表面標誌，或分化較好難以和正常細胞區別。也可能由於惡性細胞數量少，混在大量正常細胞中難以查出。近年來由於分子生物學技術的廣泛應用，且由於獲得了Ig片段的特異基因克隆及TCR各鏈的基因克隆，在此基礎上發展了應用Ig基因重排作為B細胞的特異標記，診斷B細胞來源的白血病的和應用TCR基因重排為T細胞特異標誌診斷T細胞惡性變引起的白血病，從而將白血病的細胞學分類法提高到基因水平分析，建立了免疫基因型診斷的新方法，大大提高了診斷的敏感性和特異性。該方法不但可以確定細胞來源、分化程度，且由於DNA分析的高度敏感性而能查出顯微鏡不能看到的微小變化，從而能監測治療效果，發現微量殘留病變細胞。

該方法首先要從待檢的細胞中分離出總DNA。在非T、非B細胞的Ig和TCR基因不發生重排稱為胚基因（germ line）。而T和B細胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排後的Ig和TCR片段，轉移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，然後用同位素或酶標記的Ig血病細胞進行分類鑒定，若有Ig基因重排說明惡性細胞來源於B細胞，若有TCR基因發生重排，則為T細胞來源的。如果既無Ig基因重排，又無TCR基因重排的淋巴細胞則屬非T、非B細胞來源的瘤細胞。

二、限制酶切片段長度多態性 組織配型法

迄今，一直是血清學和細胞學方法進行HLA抗原結構分析，最近已開始應用分子生物學基因克隆技術進行HLA定型。由於人們已常握了HLA共同和特異的抗原的核苷酸序列，才有可能用此新方法進行組織配型檢驗。

限制酶切片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）組織配型技術的原理是目前已掌握了編碼HLA抗原的核苷酸序列，包括各等位基因共有的和專有的序列。HLA-A、-B、-C位點的Ⅰ類重鏈基因的核苷酸序列有高度同源性，由這些基因片段克隆可得HLAⅠ類專用的探針，因為檢測HLAⅠ類抗原序列的標誌，目前也已得到Ⅱ類抗原特異的探針。由於HLA等位基因的多態性是表現在其核苷酸序列的差異上，由這些基因中克隆出的特異DNA片段，就可檢測這些基因的差別。由於核苷酸序列不同，被限制性內切酶作用部位（切點）也不同，這種酶切點只有4～6個核苷酸長度。因此來源於不同HLA單倍型的DNA可被一種內切酶切成不同長度的片段。在實際工作中，從細胞中提取基因組DNA（genomic DNA）的多態性比實際HLA-Ⅱ類抗原的多態性還要複雜，因為基因的內含子（不轉錄基因）序列不同，和外顯子（轉錄並翻譯成蛋白質）序列差別均在酶切後的細胞總DNA中。

RFLP組織配型檢測主要包括4個步聚（印跡）：①提取細胞總DNA，用限制性內切酶消化；②凝膠電泳；③將凝膠中分離好的DNA片段轉移至尼龍膜上；④經變性處理後用同位素標記的探針進行分子雜交。經放射自顯影，得到顯影帶（bands）。即可得知分子量大小不同的DNA片段（圖20-9）。

用RFLP進行組織定型比較三個標本的組織定型

圖20－9用RFLP進行組織定型比較三個標本的組織定型

RFLP組織配型實驗是用於血清學或細胞學檢測失敗的樣品，如HLA抗原不表達（裸細胞）細胞脆性大而破碎，淋巴細胞減少沒有足夠的樣品時。由於分子生物學方法採樣少、特異、敏感的優點可彌補常規方法的不足。此外，RFLP組織配型法還可查出DNA變異及基因重組的情況，而血清學方法則不能。PFLP組織配型為器官移植、骨髓移植選擇適宜的供體，用比較供體，受體限制酶切片段的長度的差異。兩者的RFLP越接近。差別越小，移植效果越好，近年來發展的PCR-RFLP以其簡單、敏感、可靠、價廉且無需同位素等優點，已取代了RELP法。