DNA重組技術

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DNA重組技術(DNA recombinant technology),將不同來源的DNA片段共價整合到有複製功能的DNA中去的技術。又稱分子克隆。該重組的 DNA分子可在寄主細胞中複製、擴增,並轉錄表達出與該外源性DNA相應的信使RNA蛋白質

DNA重組技術的主要步驟是:

①  選擇並分離能攜帶外源性 DNA的載體。常用的DNA載體有細菌質體(染色體外DNA),或噬菌體DNA,如大腸桿菌質體CoLEI及pBR322;λ噬菌體及M13噬菌體DNA等,它們都能插入(或整合)一定長度的外源性DNA片段,並能在寄主細胞中自我複製。

② 以限制性內切酶特異性水解打開載體的雙鏈DNA,使之具有特定的序列末端。不同的限制性內切酶能識別並水解打斷雙鏈 DNA中的特定序列處,如限制性內切酶ECoRI能識別下列結構並加以水解切斷。

      (打断处)
      ↓
   ………GAATTC………
 ………CTTAAG………
       ↑
    (打断处)

③  製備擬整合入質體中的外源性DNA片段(即「目的基因」),使其末端與上述經限制性內切酶切割後的載體DNA末端,具有互補的序列結構,便於粘合。

④  將該具有互補序列結構的外源性DNA片段,通過連接酶整合入載體DNA中。若載體是質體,則在整合入外源性DNA片段後,仍重新連接成環狀質體。

⑤  將此重組DNA引入寄主細胞中,使其複製和擴增。常用的寄主細胞為大腸桿菌及酵母,近已發展到用高等植物細胞及哺乳動物細胞。這類寄主細胞業經變異處理,使之喪失降解外源性DNA的能力。將載體DNA往氯化鈣磷酸鈉處理,使成DNA-磷酸鈣微粒,就易被寄主細胞內吞而轉染之。亦有用核內注射法或高壓電膜擊穿法以引入載體DNA者。

⑥  通過一定的方法篩選能複製此重組 DNA的細胞或菌落。篩選方法的基礎是質體上含有抗藥性基因,或利用該菌對某營養素的依賴表型。將該篩選出來的細胞株克隆繁殖,即能不斷複製擴增大量的該外源性重組DNA。

1972年,D.A.傑克遜成功地從兩種不同生物來源的DNA(病毒SV40分子及λ噬菌體分子),合成了第一個重組DNA分子。1973年S.科恩等成功地使重組DNA分子在寄主細胞內獲得表達。這為今後體外大規模生產某特種蛋白質的基因工程的發展奠定了基礎,使不少人體中含量極微而十分重要的蛋白質(如某些激素和因子)的生物合成,能體外實現,這對醫學和生物學的發展具有劃時代的意義。如人胰島素干擾素B型肝炎疫苗等已可用重組 DNA技術大規模生產。許多臨床診斷用的特異性基因探針,也可通過DNA重組技術的擴增而獲得,從而使很多遺傳性疾病(如 β-地中海貧血等)及B型肝炎等的診斷水平前進了一大步。試用重組DNA進行「基因治療」,將能補償某些病人對該基因的缺失,此項研究在轉基因動物中已實驗成功,應用前景誘人。

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