高效液相色譜儀
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高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內, 由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配係數, 在兩相中作相對運動時, 經過反覆多次的吸附- 解吸的分配過程, 各組分在移動速度上產生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式列印出來。
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高效液相色譜
（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似於氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恆定平穩；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由於液體流動相粘度遠遠高於氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小於氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。
使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最後通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。
發展歷史
1960年代，由於氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一台高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，標誌著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此後的時間裡，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。
1960年代前，使用的填充粒大於100μm，提高柱效面臨著困境，後來的研究人員便採用微粒固定相來突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯製備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現了高速傳質，為高效液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現。1960年代研製出氣動放大泵、注射泵及低流量往複式柱塞泵，但後者的脈衝信號很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往複式雙柱塞恆流泵，解決了這一問題。1970年代後科克蘭製備出全多孔球形矽膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，並逐漸取代了無定形微粒矽膠。之後又製造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年後，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年後，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。
高效液相色譜的特點
高壓——壓力可達150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0 mL/min。
高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
解析度高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
色譜柱可反覆使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。
高效液相色譜儀的應用
高效液相色譜法只要求樣品能製成溶液, 不受樣品揮發性的限制,流動相可選擇的範圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量範圍的物質。
與試樣預處理技術相配合,HPL C 所達到的高解析度和高靈敏度, 使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能,能夠分離複雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展, 有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。
HPL C 成為解決生化分析問題最有前途的方法。由於HPL C具有高解析度、高靈敏度、速度快、色譜柱可反覆利用, 流出組分易收集等優點,因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。
液相色譜- 質譜連用技術受到普遍重視, 如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等; 液相色譜- 紅外光譜連用也發展很快,如在環境污染分析測定水中的烴類, 海水中的不揮發烴類, 使環境污染分析得到新的發展。
高效液相色譜儀常見故障處理
L C - 10A T 高效液相色譜儀是日本島津公司1996 年的產品, 檢測器為可變波長紫外檢測器, 色譜柱為島津公司的ODS - C18 ,大連依利特的ODS -C18 。
八年的日常工作中遇到了幾種故障,如故障1 經諮詢島津公司的工程師後,得以解決;故障2、故障5 是頻繁碰到的問題等,特作總結如下:
故障1
流動相內有氣泡, 關閉泵, 打開泄壓閥, 打開p urge鍵, 清洗脫氣, 氣泡不斷從過濾器冒出, 進入流動相, 無論打開p urge 鍵幾次,都無法清除不斷產生的氣泡。
原因過濾器長期沉浸於乙酸銨等緩衝液內, 過濾器內部由於黴菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩衝液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。
處理過濾器浸泡於5 %硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡於5 %硝酸溶液中12～36 小時, 輕輕震蕩幾次, 再將過濾器用純水清洗幾次, 打開泄壓閥, 打開p urge 鍵,清洗脫氣, 如仍有氣泡不斷從過濾器冒出, 繼續將過濾器浸泡於5 %硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內部的黴菌菌團已被硝酸破壞, 流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調至1. 0～3. 0ml/ min ,純水沖洗過濾器1 小時左右。即可將過濾器清洗乾淨。關閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。
故障2
柱壓高原因(1) 緩衝液鹽分如(乙酸銨等) 沉積於柱內; (2) 樣品污染沉積。
處理對於第一種情況先用40～50 ℃的純水,低速正向沖洗柱子, 待柱壓逐漸下降後, 相應提高流速沖洗, 柱壓大幅度下降後, 用常溫純水沖洗, 之後用純甲醇沖洗柱子30 分鐘; 對於第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子, 然後換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定) , 再用換成甲醇沖洗, 然後用純水沖洗, 最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。
故障3
既無壓力指示,又無液體流過[1 >。
原因(1) 泵密封墊圈磨損; (2) 大量氣泡進入泵體。
處理對於第一種情況,更換密封墊圈;對於第二種情況,在泵作用的同時, 用一個ml 的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
故障4
壓力波動大,流量不穩定.
原因系統中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。
處理工作中注意觀察流動相的量, 保證不鏽鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣[2 >。如為單向閥和閥座之間夾有異物, 拆下單向閥, 放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗.
故障5
出峰不佳,峰分叉。
原因(1) 色譜柱被污染; (2) 柱頭填料塌陷。
處理對於第一種情況, 先用純水反向沖洗柱子, 然後換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定) , 再換成甲醇沖洗, 然後用純水沖洗,最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。如沖洗後依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對於第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料) ,裝入新填料, 滴一滴甲醇, 填料下陷, 再填, 用與柱內徑相同的頂端平滑的不鏽鋼桿壓緊, 再填平, 滴甲醇, 再壓緊反覆幾次, 直至裝滿填平[2 >。柱頭用甲醇沖洗乾淨, 擦淨柱外壁的填料, 擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30 分鐘以上。
故障6
峰面積重複性不佳。
原因(1) 進樣閥漏液; (2) 加樣針不到位。
處理對於第一種情況更換進樣閥墊圈; 對於第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液後須快速、平穩地從LOAD 狀態轉換到INJ EC T 狀態,以保證進樣量的準確。日常工作中, 液相色譜儀的保養非常重要, 如要注意不要讓空氣進入輸液系統和高壓泵中, 儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器並更換溶液, 每次用完色譜儀後緩衝液要用純水沖洗乾淨,防止無機鹽析出或沉積; 樣品的前處理也很重要,任何樣品都要儘可能地去除雜質, 完全溶解, 盡量減少對色譜柱的污染, 以延長色譜柱的使用壽命, 同時避免注射過濃的樣品溶液, 以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞; 色譜柱作好標記,用於不同分析目的的色譜柱不要混用等。
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