基因診斷與性病/核酸分子雜交法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因診斷的分子生物學基礎
- 核酸分子雜交法
- 基因擴增技術（PCR）

這是最早用於性病診斷的重組DNA技術。基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按鹼基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。待測核酸序列為性病病原體基因組或質體 DNA。探針以放射核素或非放射性核素標記，以利於雜交信號的檢測。

所謂雜交（hydridization）指兩個以上的分子因具有相近的化學結構和性質而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid），雜交體中的分子不是來自一個聚體分子。同一個二聚體中的兩個分子在變性解離後重組合稱為復性。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術相對應的另一項技術被稱為探針技術，它是指利用標記分子對其它分子的識別性而實現對後者進行檢測的一種技術，我們把標記的分子叫探針（Probe）。將探針技術與分子雜交技術相結合，從而使分子雜交技術得以廣泛推廣應用。目前所用的核酸雜交技術均應用了標記技術。

（一）DNA的變性

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規則線團，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。

（二）DNA復性

變性DNA只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結合，恢復原來的雙螺旋結構，這一過程稱為復性。復性後的DNA，理化性質都能得到恢復。

核酸分子單鏈之間有互補的鹼基順序，通過鹼基對之間非共價健的形成即出現穩定的雙鏈區，這是核酸分子雜交的基礎。雜交分子的形成並不要求兩條單鏈的鹼基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由於DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進行分子雜交時，應先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現。使單鏈聚合成雙鏈過程稱為退火或復性。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。

（三）探針——靶分子反應

從化學和生物學意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應後檢測的合適標記物，並與特異靶分子反應。抗體——抗體、外源凝集素——碳水化合物、親合素——生物素、受體——配基（Ligand）以及互補核酸間的雜交均屬於探針——靶分子反應，蛋白質探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水離子和氫鍵）的作用在少數特異位點上的結合，而核酸探針與互補鏈的反應則是根據雜交體的長短不同，通過氫鍵幾十、幾百甚至上千個位點上的結合。這就決定它的特異性。

基因探針根據標記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據探針的核酸性質不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。