臨床生物化學/核酸一級結構(核苷酸序列sequence)分析

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核酸一級結構分析是基因分析最直接的第一手資料。目前DNARNA以及蛋白質的一級結構分析中,DNA的鹼基序列分析方法多樣、簡單、快速。下面就M13噬菌體-雙脫氧核苷酸(ddNTP)的DNA測序法介紹如下。

M13是單鏈DNA噬菌體,轉染宿主菌體複製為雙鏈增殖,又以單鏈形式透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13複製型DNA中,經培養擴增,可分離得到單鏈M13DNA(含待測單鏈DNA的鹼基序列),即複製模板。在待測DNA的3′端人工合成引子,在DNA聚合酶Ⅰ作用下,複製鏈延長。在ddNTP(2′,3′雙脫氧核糖核苷三磷酸)存在下,複製延長隨機受阻,形成分子量(長度)大小不等的片段。電泳分離,自顯影,讀圖18-9分析鹼基序列。

核酸鹼基序列分析


圖18-9 核酸鹼基序列分析

0.2-0.3mm厚度聚丙烯醯胺-尿素凝膠高壓(1600V)電泳,可分辨一個核苷酸的差異。電泳後乾燥凝膠,自顯影,自下往上讀圖,得到5′→3′的合成鏈鹼基序列,其互補鏈是待測DNA的3′→5′鹼基序列。

32 核酸限制性片段長度多態性(RFLP)分析 | 診斷分子生物學技術的臨床應用 32
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