臨床生物化學/方法建立時的條件選擇

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在方法建立的原理確定後,尚需根據其原理來選擇合適的條件,以保證所建的方法可靠。下面以亮度法為例介紹其條件選擇的主要環節。顏色反應是亮度分析的基礎,因此,用作亮度測定的顏色反應至少要具備以下幾條:反應有較高的特異性,從而干擾小;反應產生的有色物質吸光係數要大,大者靈敏度高;有色產物的離解度要小,小則穩定;此外,還要求有色產物有恆定的組成成分,使產生的顏色穩定。由於影響顏色反應的因素很多,如溫度、pH、試劑濃度、反應的時間等等。這些因素在建立新方法時都要逐項試驗,確定最佳實驗條件。

(一)選擇合適的吸收光譜

實際上就是測定顏色反應產生的光吸收曲線。方法是在整個可見光區(400-700nm)以10nm(在接近最大吸收波長範圍還應再細分)間隔。分為十幾個點測定其在不同波長時的吸光度,然後以吸光度為縱坐標,波長為橫坐標繪成光吸收曲線。在條件許可的情況下,應採用雙光束分光光度計在可見光區進行波長掃描,結果較為可靠。同時,還應以同法分別測定其空白液和標準物顏色產物的吸收曲線。測定光吸收曲線的目的是找出最大吸收波長,作為光度法波長選擇的依據。因為在最大吸收波長測定,可獲得最大靈敏度,且能更符合比耳定律。然而在實際使用中,不能單純考慮靈敏度高,還要考慮在測定濃度範圍能否符合比耳定律,並能在光度計準確區域內(吸光度0.2-0.85之間)讀出讀數。有時由於測定的最大吸收波長並不是所要測定物質的特性吸收波長,即同時存在具有相似最大吸收的干擾物質,為了保證實驗的特異性,常改用特有而非最大吸收波長進行測定。例如用磷鉬酸測定血糖,選用波長420nm,溶液對此波長的吸收比其它波長光線的吸收都低,其目的是使參考值有一個較低的吸收,這樣可允許在相同情況下對高出參考值的血糖也能得到準確的讀數。因為在這項測定中,高血糖是常見的變化方向。

(二)測定方法適用的濃度範圍

根據光吸收定律,溶液的吸光度應與溶液的濃度成正比。但由於有色物質的電離、水解、締合等原因當溶液稀釋或增濃時,有色物質顏色的深淺並不按比例降低或增高,因而也就不符合光吸收定律。測定方法適用的濃度範圍是指分析的濃度範圍在直線線性段,濃度與吸光度之比為一常數,此時直線上任何一點的斜率tanθ相等,即:

tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……=An/Cn=K

此處K即為校正常數,可用於結果計算。

通常稀溶液都是符合比耳定律的,但在濃度過高和過低時往往都不呈直線,說明低濃度部分亦有儀器的靈敏度和方法的檢測能力限制,所以,具體的測定就宜選擇在直線段濃度範圍內進行。以此還可用於確定標本的用量,使具有臨床意義的標本測定結果都落在直線範圍內。

(三)觀察影響顏色反應的因素

影響顏色反應的主要因素有:溶液pH的影響、雜質的影響、反應的溫度和時間、以及顏色的穩定性等。這些都是光度法測定誤差的主要來源。都需要通過實驗來觀察並控制在一個適宜的範圍內。從而保證方法的準確性和精密性。

⒈溶液pH的影響有些溶液的顏色對pH值的改變非常靈敏。例如白蛋白在pH4左右可與溴甲酚綠結合後由黃色變成綠色,綠色的深淺與白蛋白濃度成正比,但是溴甲酚綠本身是一種pH指示劑,當pH5.4時即由黃色轉變成綠色,在pH3.8時又由綠色變為黃色。在白蛋白與溴甲酚綠結合顏色反應中,如pH控制不好就很容易出現誤差,又如每種酶都有各自的最適pH,酶促反應中,只有在其最適pH時才能發揮充分的催化活性。因此,在建立方法時可在不同pH值條件下(其它條件不變)令其反應,以觀察顏色反應的吸光度變化,從而選擇合適的pH值範圍來保證顏色反應,以求較高的靈敏度和較好的線性。有時還需用相應的pH緩衝液來維持反應的pH,以利顏色反應的正常進行。

⒉雜質的影響由於臨床生化標本中除含待測物質外,還含有許多非測定物質,成分十分複雜,它們有的可與有色產物作用,使產生的顏色逐漸退去,有的與待測物質相類似,也能緩慢地與顯色試劑生成有色化合物或沉澱,有的本身是有色的等,都會影響被測物溶液的顏色。試驗方法是將各種可疑物質的純溶液作標本單獨進行測定,如產生顏色反應,這說明該方法的特異性不高。如果將待測物質混入可疑物質作標本測定,改變了被測物質與試劑間的反應,這是干擾(具體方法見第三節)。為此就需要進一步改進方法,或設立標本空白,或將標本作適當處理,除去干擾物,或加入合適的干擾物掩蔽劑等,以提高方法的特異性。

⒊反應的溫度和時間有些有色物質能迅速反應生成,另一些有色物質須經過相當長時間後反應才能完全。提高反應的溫度可以加速化學反應,縮短反應的時間。因此,如果在不恰當的溫度和時間內進行比色,將會造成相當大的誤差。這可以在不同的溫度下(如設定25℃,30℃,37℃)令其反應,通過檢測吸光度來觀察各自反應終點時間(一般達到反應終點,隨後測定的吸光度不再變化),以選定適宜臨床應用的反應最佳溫度和時間。

⒋穩定性試驗待測物質經顯色反應產生的有色物穩定與否,關係到測定結果的可靠性。某些有色物質雖然生成很快,但卻不太穩定,放置後色澤會逐步消退或起變化,有些干擾物雖不能與被測物質同時發生顏色反應,但當放置一段時間後也能緩慢地與試劑顯色,使溶液顏色加深。因此,在方法建立的同時作穩定性試驗很有必要。試驗的方法是用被測標本、標準溶液、空白溶液按方法要求進行顯色反應後,即刻及室溫放置不同時間,分別測定其吸光度,根據其吸光度的變化確定方法穩定的時間範圍。一般要求有色溶液能穩定二小時以上就能滿足臨床應用的需要。必要時還要加以註明。

32 方法建立的原理確定 | 方法建立後的臨床觀察 32
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