基礎檢驗學/血塗片的製備和細胞染色

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血塗片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法,臨床上應用極為廣泛,特別是對於各種血液病的診斷具有重要的價值,近年來血細胞分析儀的廣泛應用,血塗片的觀察也可作為判斷儀器結果的簡易方法。比台觀察10個高倍視野血塗片中白細胞血小板數大致估計血內這些細胞的數量,藉以作為儀器結果分析後質控的參考。

但積壓塗片製備和染色不良,常使細胞鑒別發生困難,甚至導致錯誤結論。例如,血膜過厚細胞重疊縮小,血膜太薄白細胞多集中於邊緣,細胞分布不勻;染色偏酸或偏鹼均可使細胞染色反應異常。因皮製備厚薄適宜,分布均勻,染色良好的血塗片是血液學檢查的重要基本技術之一。

血塗片製備方法及注意事項將在實習指導中詳細介紹。

1.瑞特(Wright)染色法:為發觀察細胞內部結構,識別各種細胞及其異常變化,血塗片必須嘲行染色。血塗片的各種染色方法大多是羅氏染色法衍變來的。目前常用瑞特染色法。

(1)瑞特染料是由酸性染料伊紅和鹼性染料亞甲藍組成有複合染料。亞甲藍為四甲基硫堇染料,有對醌型和鄰醌型兩種結構。通常為氯鹽,即氯化美藍。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。即伊紅和伊混合後,產生一種憎液性膠體伊紅美藍中性沉澱,即瑞特染料。

(2)細胞的染色既有物理的吸附作用,又有化學的親和作用,各種細胞成分化學性質不同,對各種染料的親和力也不一樣。因此,用本染料液染色後,在同一血片上,可以看到各種不同的色彩,例如血紅蛋白,嗜酸性顆粒為鹼性蛋白質,與酸性染料伊紅結果,染粉紅色,稱為嗜酸性物質;細胞核蛋白淋巴細胞胞漿為酸性,與鹼性染料美藍或天青結合,染紫藍色,稱為嗜鹼性物質;中性顆粒呈等電狀態與伊紅和美藍均可結合,染淡紫色,稱為中性物質。

(3)PH對細胞染色有影響。細胞各種成分均不蛋白質,由於蛋白質系兩性電解質,所帶電荷隨溶液PH而定,在偏酸性環境中下在電荷增多,易與伊紅結合,染色偏紅;在偏三性環境中負電荷增多,易與美藍或天青結合,染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感,染色用正經片必須清潔,無酸鹼污染。配製頊特液必須用優質甲醇,稀釋染色必須用緩衝液,沖洗用水應近中性,否則可導致各種細胞染色反應異常,以致識別困難,甚至造成錯誤。

新鮮配製的染料偏鹼,須在室溫或是37℃下貯存一定時間,待染料成熟,主要是美藍逐漸轉變為天青B後才能使用,貯存時愈久,染色效果愈好。EAm GILLILAND等採用吸光度比值作為頊特染液的質量規格。rA測定方法如下:取瑞特染液15-25μl(視染液濃度而定),加甲醇10ml稀釋,混勻後以甲醇為空折管,分別以波長650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因為美藍吸收峰小組長為650nm,伊紅吸收峰波長為525nm ;天青B吸收峰也為650nm但吸光度A約為美藍的一半。所以新配染料rA接近2,隨著美藍逐漸氧化為天青B,RA也相應下降。RA下降到1.3±0.1時即可使用。瑞特染液貯存過程中,必須塞嚴,以防止甲醇揮發和被氧化成甲酸。有人主張在配方中加入甘油30ml,防止甲醇揮發,關可合細胞染色清晰。甲醇必須純淨,如甲醇中丙酮含量過多,染色偏酸,使白細胞著色不良。

2.吉姆薩(Giemsa)染色法:吉姆薩染液由天青,伊紅組成。染色原理和結果與瑞特染色法基本相同。但本法對細胞核和寄生蟲著色較好,結構顯示更不清晰,而胞質和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長,可用複合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩衝液,按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色後,再用稀釋吉姆薩復染

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