聚合酶鏈式反應

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PCR流程

   聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種分子生物學技術,用於放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA複製。  

PCR技術

目錄

PCR原理

DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引子,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。

但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。

發現耐熱DNA聚合酶--Taq酶對於PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引子。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:

①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引子結合,為下輪反應作準備;

②模板DNA與引子的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引子與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

③引子的延伸:DNA模板--引子結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈,重複循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。     

PCR原理

PCR步驟

標準的PCR過程分為三步

1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA

2.退火(25℃-65℃):系統溫度降低,引子與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP為原料,從引子的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。如圖所示:

現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內複製完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。     

PCR反應特點

(1)特異性強

PCR反應的特異性決定因素為:

①引子與模板DNA特異正確的結合;

鹼基配對原則;

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;

④靶基因的特異性與保守性。

其中引子與模板的正確結合是關鍵。引子與模板的結合及引子鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引子的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。

(2)靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

(3)簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好後,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。

(4)對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等DNA擴增檢測。  

PCR的循環參數

1、預變性(Initial denaturation):模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。 

2、循環中的變性步驟:循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。

3、引子退火(Primer annealing):退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引子的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4、引子延伸:引子延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略。延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。 

5、循環數:大多數PCR含25-40循環,過多易產生非特異擴增。

6、最後延伸:在最後一個循環後,反應在72℃維持5-15分鐘.使引子延伸完全,並使單鏈產物退火成雙鏈。

PCR儀器

  

PCR學習視頻

參看

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