多肽合成儀
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一、基本概念 1.多肽 是一種與生物體內各種細胞功能都相關的生物活性物質，它的分子結構介於胺基酸和蛋白質之間，是由多種胺基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的化合物。 2.多肽合成 是一個重複添加胺基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點，從而大大的減輕了每步產品提純的難度。多肽合成總的來說分成兩種：固相合成和液相多肽合成。 3.多肽合成儀 多肽合成是一個以樹脂（人工合成的固相介質）為載體，在一定的反應條件下重複添加胺基酸，經過化學反應後合成多肽的過程，多肽合成儀即是用來合成多肽的儀器。一般情況下，多肽合成儀整體由主體、傳輸設備、動力裝置以及軟體系統組成。
二、歷史背景 1． 固相合成法的誕生 多肽合成研究已經走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由於當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用苄氧羰基(Z)來保護α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發展。 到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及胺基酸保護基上面也取得了不少成績，這為後來的固相合成方法的出現提供了實驗和理論基礎。 1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現就由於其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且帶來了多肽有機合成上的一次革命，並成為了一支獨立的學科——固相有機合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反覆的篩選，最終屏棄了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用於保護α-氨基並在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發明了第一台多肽合成儀，並首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個胺基酸)。 1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用於保護α-氨基，其在鹼性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全，而且由於其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，並仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及胺基酸保護基，包括合成環肽的胺基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。
2． 多肽合成儀的誕生 雖然Merrifield在發明固相多肽合成科學並取得巨大成功的同時，使用了自主研發的合成設備，但卻沒因此將多肽合成儀引入市場。1970年，Beckman公司開發的全自動多肽合成儀Beckman 990 Peptide Synthesizer 作為第一台投入市場的科研用多肽合成儀，被美國多所大學的實驗室採用。 幾乎同一時間，Vega Biotechnologies, Inc.公司開發出兩款經濟型多肽合成儀：Vega』s Coupler 1000與Vega』s Coupler 250 (不久又推出Vega』s Coupler 296),其將多肽合成後續的在線切割理念結合到設備中，所有反應器採用防爆玻璃材質，防止TFA的腐蝕。被當時的肽化學界稱為最經濟適用的多肽合成儀。 而今，Beckman與Vega』s兩家公司均停止的多肽合成儀的研發與製造，而轉向到更多面的化學合成、分離、檢測技術設備的研製產業中。
3． 多肽合成儀的發展 a) 第一代多肽合成儀
第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。
雖然隨著生產工藝的改進和發展，如今第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發而來，第一代的多肽合成儀為之後的合成儀研發與製造產生了重大意義。
b) 第二代多肽合成儀
第二代多肽合成儀是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90為代表的，誕生在上世紀八十年代。此兩款設備也是目前市場上仍在銷售的最早的多肽合成儀。 PS3 的設計原理是採用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會「抱團」，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除後要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓力會把多肽-固相載體「吹」到反應器液面上方。由於多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反應「死角」的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發，液面降低後一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。 ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都不能夠完全達到胺基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。
c) 第三代多肽合成儀
第三代多肽合成儀是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336為代表的無死角多肽合成儀為代表的，誕生在上世紀九十年代。 ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正做到了無死角。由於攪拌速率可達每分鐘1800轉的高速，反應得以充分完全。由於無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場後最後一款儀器）至今在世界上還佔有著很大的比例。當然，ABI產品的售價也是最高的。由於部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。 CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其採用了氮氣鼓泡反應方式的優越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現。
4． 多肽合成儀的現狀 進入二十世紀以來，各大合成儀製造公司相繼推出了升級產品和新產品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將「簡訊通知」功能融入產品，增添了用戶與設備之間的緊密感，更加人性化；C S Bio公司對其從研髮型到生產型設備的UV Online Monitor系統配置統一升級，用戶可直觀看到每一部胺基酸偶聯反應的狀態並可根據數據調整出最佳合成效果與工藝；Advanced ChemTech公司自2005年破產重組後分裂為兩家新公司，其中Aapptec延續了其前身的生產步驟，推出Focus XC三通道合成儀。美國另一家公司CEM以蛋白質有機反應設備的製造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡單的小分子多肽。其採用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍。可惜的是在加熱的情況下副反應也相應增多，多肽純度不能與之前的第三代甚至第二代產品媲美。另外，微波加熱方法無法放大，故不適合用作多肽藥物的研發。
三、功能研究 1． 運行原理 多肽合成儀以固相合成為反應原理，在密閉的防爆玻璃反應器中使胺基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生，參加反應的胺基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的，並且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由於Fmoc比tBoc存在很多優勢，現在大多採用Fmoc法合成，但對於某些短肽，tBoc因其產率高的優勢仍然被很多企業所採用。
具体合成由下列几个循环组成：
1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。 2） 激活和交聯：下一個胺基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反覆循環直到合成完成。 3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。
2． 基本元件 a) 反應器 Reaction Vessel 數百年來，製藥業的反應器/反應釜 設備以玻璃材質最為常見，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監測，同時合成後可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質最為適用。 而玻璃材質的反應器在製造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國產設備都無法達到要求出現漏液漏氣現象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理 b) 胺基酸儲罐 Amino Acid Reservoirs c) 溶劑儲罐 Solvent Reservoirs d) 量筒 Metering Vessel e) 轉液瓶 Transfer Vessel f) 感應器 Sensor 多端觸發器自感應定量量取法，直觀、科學、相對誤差最低。 g) 廢液桶 Waste Carboy 廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶，保證通風良好，同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況，避免溢出。 3． 控制配件 a) 電磁閥 Valves 多肽合成儀中的電磁閥屬於敏感配件，其控制液路的串聯與閉路，在胺基酸轉移與量取，溶劑轉移與量取兩步驟中起到至關重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。如PTI合成儀中，電磁閥成矩陣式排列，便於觀察，但若發生堵塞情況則又有維修的不便，一個電磁閥堵塞則可能造成整塊矩陣式電磁閥全部更換；CSBio合成儀中電磁閥採取Normally Close 方式，在非溶液轉移操作過程中，電磁閥閉合，減少了污染與堵塞的發生，整體呈管路式排布；ABI433合成儀的電磁閥為7位組合，萬一出現堵塞情況則整組更換，查找檢修時非常方便，但成本也相對高了6倍。 b) 控制面板 Control Box 控制面板內往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統、合成儀統一的連結在一起，完成多肽合成的全過程。 c) 軟體系統 Operating Software 多肽合成儀的操作軟體。不同品牌合成儀所註冊的軟體也不同。
4． 檢測方法 a) UV Monitor 在多肽合成儀中，在線檢測耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部胺基酸偶聯效果，從而針對特定的序列做合成設置的調整，最終達到最佳合成效果。 對於不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說，UV Monitor是相當重要的。
b) 試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以採用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。 Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液 配製中的吡啶需要經過茚三酮處理後，重蒸後再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。 c) 其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。
四、專利文件 對於大學、實驗室等科研用戶以及需要申報新藥的生產企業來講，使用的合成設備的國際專利號以及規定內容是非常有用的信息。 ACT多肽合成儀專利：United States Patent 4746490 Activotec合成應用技術專利： IPC8 Class: AC07K104FI USPC Class: 525 5411 CEM合成技術專利：US 7,582,728 C S Bio多肽合成儀專利：US Patent 5,380,495 & 5,453,487. C S Bio多肽合成儀反應器專利：US Patent 6320025 PTI多肽合成儀設備專利： U.S. Patent No. 5,203,368 (Symphony). No. 5,064,940 (PS3). PTI多肽合成儀反應器專利：U.S. Patent No. 5,980,839. Shimadzu多肽合成儀專利：United States Patent 5344613
五、選購指南 1． 科研單位考慮因素 a) 設備本身對實驗研究的幫助 ①對於多肽合成化學反應，使用設備可避免人手工操作對人體的傷害(試劑腐蝕) ②由於程序化設定，可保證每步驟偶合反應的充分性以及實驗整體的穩定性 ③可以合成難肽以及超長肽(可提供其使用研究型多肽合成儀合成多肽的檢測報告) ④在休息時間可以不間斷合成工作 研究型多肽合成儀需滿足循環式胺基酸添加位置多於20個，在夜間以及周末，預先配好的保護胺基酸可根據程序設置自動偶聯並替換新的位置，保證了實驗的效率，完全實現全自動！ ⑤即使實驗進行了很多年，更換了很多研究人員，實驗數據還可以保存在電腦中。 b) 國際國內相關研究人員使用該多肽合成儀進行的有效研究結果 多肽合成儀的製造商應提供其公開發表的研究性論文多篇。 為進行多肽合成實驗的學生們提供研究數據並使其模擬合成過程，更好的體驗機械操作多肽合成的全步驟，檢測自己的合成結果。 c) 多肽合成儀設備的專利保護對今後研究結果的影響 考慮到高等院校實驗研究的嚴密性，結合對後期研發成果的保護機制，通常採購的設備需要具有其國際專利許可，以確保實驗研究項目的順利申報。 d) 製造商的生產規模 製造商的品牌、生產規模以及其所擁有的生產資格認證，都從側面反映了其供應設備的質量、信譽以及對客戶的服務保證。
2． 生產企業考慮因素 參考科研單位選購小型設備的考慮因素，對於生產型企業，使用不同品牌的多肽合成儀往往還應考慮其連貫完整的設備生產線，從小型合成規模至生產型合成規模的各種設備齊全。通常大型設備可根據反應器大小判斷其合成規模，通常可在線切割的玻璃材質反應器/反應釜需達100L，可保證批量產數十公斤的多肽產品。
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