琥珀酸脫氫酶

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琥珀酸脫氫酶有兩種,一種是以泛醌作為受體的,另一種是作用於所有受體。

琥珀酸脫氫酶(泛醌)

EC編號:1.3.5.1

通用名:琥珀酸脫氫酶(泛醌)

英文:Succinatedehydrogenase(ubiquinone)

催化反應:琥珀酸+泛醌=富馬酸+泛醇

系統名稱:琥珀酸:泛醌氧化還原酶

CAS號:9028-11-9

注釋:是含鐵-硫中心的黃素蛋白。存在於粒線體中。

琥珀酸脫氫酶

EC編號:1.3.99.1

通用名:琥珀酸脫氫酶

英文:Succinatedehydrogenase

催化反應:琥珀酸+受體=富馬酸+被還原的受體

系統名稱:琥珀酸:(受體)氧化還原酶

CAS號:9002-02-2

注釋:是含鐵-硫中心的黃素蛋白

【摘要】琥珀酸脫氫酶是粒線體的一種標誌酶,是連接氧化磷酸化電子傳遞的樞紐之一,可為真核細胞粒線體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子,其活性一般可作為評價三羧酸循環運行程度的指標。本文從琥珀酸脫氫酶的提取、純化及活性檢測方法等幾方面介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進展情況。

【關鍵詞】琥珀酸脫氫酶粒線體三羧酸循環

琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase,簡稱SDH),黃素酶類,是粒線體內膜的結合酶,屬膜結合酶,是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一,可為真核細胞粒線體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子,為粒線體的一種標誌酶。作為參與三羧酸循環的關鍵酶,琥珀酸脫氫酶是反映粒線體功能的標誌酶(markerenzyme)之一,其活性一般可作為評價三羧酸循環運行程度的指標[1],對於評價精子粒線體功能、研究致奶牛酮缺乏症病理過程等具有重要意義[2~3]。

本文從琥珀酸脫氫酶的提取、純化、性質及其測定方法等幾方面回顧並介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進展情況。

1琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義

琥珀酸脫氫酶存在於所有有氧呼吸細胞,和粒線體膜牢固結合,是三羧酸循環中唯一與內膜結合的酶,是脫氫酶中最重要的酶。迄今為止,已從多種原核和真核組織中分離純化出這種酶,為該酶的酶學研究奠定了基礎。作為膜內酶,琥珀酸脫氫酶與具有脂雙層結構的粒線體膜結合得比較緊密,很難溶解下來,而且其一旦離開膜後,暴露在空氣中會很快失活,因此其提純難度很大。1950年我國著名生物化學家王應睞、鄒承魯、汪靜英等開展對膜蛋白琥珀酸脫氫酶的研究,經過反覆實驗最後以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脫氫酶從鼠肝組織粒線體膜上溶解下來,得到了高純度的水溶性琥珀酸脫氫酶,其活力比同期國外報導者高出1倍以上,從而奠定了我國在琥珀酸脫氫酶研究領域的領先地位[4]。其後,Davis等(1971、1977)使用NaClO4從牛心線粒體溶解下此酶[5~6];TsukahoHattori和TadashiAsahi(1982)選用離子型去垢劑脫氧膽酸鈉從番薯根粒線體提取SDH[7];Suraveratum等(2000)對惡性瘧原蟲的琥珀酸脫氫酶進行了純化[8];夏玉鳳等(2000)以玉米黃化苗為生物材料,通過差速離心獲得粒線體,使用超聲波將其破碎,用2%TritonX-100溶膜,超速離心,硫酸銨沉澱,DEAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶[9];辛明秀等(2004)用常規酶學方法從嗜冷酵母(Y18)中分離純化出有催化活性的琥珀酸脫氫酶[10]。

琥珀酸脫氫酶是直接連在電子傳遞鏈上的,氫受體是FAD而不是NAD+,它使琥珀酸氧化為延胡索酸過程中所產生的FADH2與酶結合,將來自FADH2的兩個電子直接傳遞給酶的Fe3+[11~12]。現有研究表明,琥珀酸脫氫酶由α、β兩個亞基組成,α亞基相對分子質量為70.0×103,含有FAD和兩個鐵硫簇;β亞基相對分子質量為27.0×103,含有一個鐵硫簇[13~14]。

2琥珀酸脫氫酶的常用測定方法 琥珀酸脫氫酶活力測定方法目前主要有五種。

2.1硫酸甲酯吩嗪(PMS)反應法[15~16]琥珀酸脫氫酶能通過一系列人工電子受體,如與PMS(吩嗪二甲酯硫酸鹽),DCPIP(2,6-二氯酚靛酚)等發生反應催化琥珀酸的氧化,而藉助這些中間產物的顏色變化,通過分光光度計檢測即可加以定量反映,其反應式為:①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2;②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈藍色,標準的吸收光譜在600nm處,這種色澤可因其還原而漸次變淡,從而600nm處的光密度的變化與DCPIP含量成正比,測定2.6-DPIP的還原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被還原,即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測定此反應系統在600nm處的吸收光度變化,來計算SDH的活性。SDH活性計算:(標準-測定)/標準=μmol/min/mg。

2.2鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]還原法以鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]和琥珀酸鈉底物,使琥珀酸脫氫酶催化反應將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6],K4Fe(CN)6再與Fe3+作用生成普魯士藍,在700nm波長測定吸光值,以檢測普魯士藍之生成量,作為琥珀酸脫氫酶的還原力,吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強。

2.3TTC(氯化三苯四氮唑)法無色TTC(2,3,5-氯化三苯基四唑)作為人造受氫體,它在細胞呼吸過程中接受氫,還原成三苯基甲膳(TF)。後者以紅色晶體的形式存在於細胞內,採用有機溶劑(如甲苯乙酸乙醋、三氯甲烷丙酮乙醇等)進行萃取。萃取液測定485nm吸光度後,以TTC還原量表示脫氫酶活性,根據標準曲線計算TF生成量,進而求出TTC-脫氫酶活性。

2.4MTT法MTT是一種黃顏色的染料。活細胞粒線體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT,同時在細胞色素C的作用下生成藍色(或藍紫色)不溶於水的甲臢(Formazana),經異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下,甲臢生成量與活細胞數成正比,因此可根據光密度570nm處OD值推測出活細胞的數目。

2.5NBT(氯化硝基四氮唑藍)法[17]NBT易溶於水,呈淡黃色,以NBT為受氫體,接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫,進而形成紫藍色的沉澱,於反應體系中加入PMS,混勻,37℃保溫30min,之後加入TCA終止反應。加異丙醇溶解顯色,混勻,即可於548nm測OD值。規定:30min內548nm下OD值為1.0時的酶量為1個活力單位。比活力=活力單位數/毫克蛋白

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