光學顯微鏡

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      光學顯微鏡是利用光學原理,把人眼所不能分辨的微小物體放大成像,以供人們提取微細結構信息的光學儀器。  

目錄

歷史

早在公元前一世紀,人們就已發現通過球形透明物體去觀察微小物體時,可以使其放大成像。後來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規律有了認識。

1590年,荷蘭和義大利的眼鏡製造者已經造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前後,義大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時,改變物鏡目鏡之間的距離,得出合理的顯微鏡光路結構,當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的製造、推廣和改進。

17世紀中葉,英國的羅伯特.胡克和荷蘭的列文.虎克,都對顯微鏡的發展作出了卓越的貢獻。1665年前後,胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明系統和承載標本片的工作台。這些部件經過不斷改進,成為現代顯微鏡的基本組成部分。

1673~1677年期間,列文胡克製成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡,其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自製的顯微鏡,在動、植物機體微觀結構的研究方面取得了傑出的成就。

19世紀,高質量消色差浸液物鏡的出現,使顯微鏡觀察微細結構的能力大為提高。1827年阿米奇第一個採用了浸液物鏡。19世紀70年代,德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。這些都促進了顯微鏡製造和顯微觀察技術的迅速發展,並為19世紀後半葉包括科赫、巴斯德等在內的生物學家和醫學家發現細菌和微生物提供了有力的工具。

在顯微鏡本身結構發展的同時,顯微觀察技術也在不斷創新:1850年出現了偏光顯微術;1893年出現了干涉顯微術;1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創造了相襯顯微術,他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學獎。

古典的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合,它以人眼作為接收器來觀察放大的像。後來在顯微鏡中加入了攝影裝置,以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。現代又普遍採用光電元件、電視攝象管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器,配以微型電子計算機後構成完整的圖象信息採集和處理系統。

表面為曲面的玻璃或其他透明材料製成的光學透鏡可以使物體放大成像,光學顯微鏡就是利用這一原理把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。近代的光學顯微鏡通常採用兩級放大,分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體位於物鏡的前方,被物鏡作第一級放大後成一倒立的實象,然後此實像再被目鏡作第二級放大,成一虛象,人眼看到的就是虛像。而顯微鏡的總放大倍率就是物鏡放大倍率和目鏡放大倍率的乘積。放大倍率是指直線尺寸的放大比,而不是面積比。  

光學顯微鏡的組成結構

光學顯微鏡一般由載物台、聚光照明系統、物鏡,目鏡和調焦機構組成。載物台用於承放被觀察的物體。利用調焦旋鈕可以驅動調焦機構,使載物台作粗調和微調的升降運動,使被觀察物體調焦清晰成象。它的上層可以在水平面內沿作精密移動和轉動,一般都把被觀察的部位調放到視場中

光學顯微鏡結構

心。

聚光照明系統由燈源和聚光鏡構成,聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應。

物鏡位於被觀察物體附近,是實現第一級放大的鏡頭。在物鏡轉換器上同時裝著幾個不同放大倍率的物鏡,轉動轉換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路,物鏡的放大倍率通常為5~100倍。

物鏡是顯微鏡中對成象質量優劣起決定性作用的光學元件。常用的有能對兩種顏色的光線校正色差的消色差物鏡;質量更高的還有能對三種色光校正色差的復消色差物鏡;能保證物鏡的整個像面為平面,以提高視場邊緣成像質量的平像場物鏡。高倍物鏡中多採用浸液物鏡,即在物鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體,它能顯著的提高顯微觀察的解析度。

目鏡是位於人眼附近實現第二級放大的鏡頭,鏡放大倍率通常為5~20倍。按照所能看到的視場大小,目鏡可分為視場較小的普通目鏡,和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。

載物台和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對運動以實現調焦,獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時,容許的調焦範圍往往小於微米,所以顯微鏡必須具備極為精密的微動調焦機構。

顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率,顯微鏡的解析度是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距。解析度和放大倍率是兩個不同的但又互有聯繫的概念。

當選用的物鏡數值孔徑不夠大,即解析度不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結構,此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是一個輪廓雖大但細節不清的圖像,稱為無效放大倍率。反之如果解析度已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發揮顯微鏡的分辨能力,應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

聚光照明系統是對顯微鏡成像性能有較大影響,但又是易於被使用者忽視的環節。它的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發來的光束應能保證充滿物鏡孔徑角,否則就不能充分利用物鏡所能達到的最高解析度。為此目的,在聚光鏡中設有類似照相物鏡中的 ,可以調節開孔大小的可變孔徑光闌,用來調節照明光束孔徑,以與物鏡孔徑角匹配。

改變照明方式,可以獲得亮背景上的暗物點(稱亮視場照明)或暗背景上的亮物點(稱暗視場照明)等不同的觀察方式,以便在不同情況下更好地發現和觀察微細結構。  

光學顯微鏡的分類

光學顯微鏡有多種分類方法:按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡;按圖像是否有立體

感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡;按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等;按光學原理可分為偏光,相襯和微差干涉對比顯微鏡等;按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和雷射顯微鏡等;按接收器類型可分為目視、攝影和電視顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外熒光顯微鏡等。

雙目體視顯微鏡是利用雙通道光路,為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質上是兩個單鏡筒顯微鏡並列放置,兩個鏡筒的光軸構成相當於人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角,以此形成三維空間的立體視覺圖像。雙目體視顯微鏡在生物、醫學領域廣泛用於切片操作和顯微外科手術;在工業中用於微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。

金相顯微鏡是專門用於觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察,故金相和普通顯微鏡的主要差別在於前者以反射光,而後者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面,被物面反射後再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用於集成電路矽片的檢測工作。

紫外熒光顯微鏡是用紫外光激發熒光來進行觀察的顯微鏡。某些標本在可見光中覺察不到結構細節,但經過染色處理,以紫外光照射時可因熒光作用而發射可見光,形成可見的圖像。這類顯微鏡常用於生物學和醫學中。

電視顯微鏡和電荷耦合器顯微鏡是以電視攝像靶或電荷耦合器作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入電視攝像靶或電荷耦合器取代人眼作為接收器,通過這些光電器件把光學圖像轉換成電信號的圖像,然後對之進行尺寸檢測、顆粒計數等工作。這類顯微鏡的 可以與計算機聯用,這便於實現檢測和信息處理的自動化,多應用於需要進行大量繁瑣檢測工作的場合。

掃描顯微鏡是成像光束能相對於物面作掃描運動的顯微鏡 。在掃描顯微鏡中依靠縮小視場來保證物鏡達到最高的解析度,同時用光學或機械掃描的方法,使成像光束相對於物面在較大視場範圍內進行掃描,並用信息處理技術來獲得合成的大面積圖像信息。這類顯微鏡適用於需要高解析度的大視場圖像的觀測。粗准焦螺旋:大範圍上下調動鏡筒。

細准焦螺旋:小範圍上下調動鏡筒。  

顯微鏡

顯微鏡是一種精密的光學儀器,已有300多年的發展史。自從有了顯微鏡,人們看到了過去看不到的許多微小生物和構成生物的基本單元——細胞。目前,不僅有能放大千餘倍的光學顯微鏡,而且有放大幾十萬倍的電子顯微鏡,使我們對生物體的生命活動規律有了更進一步的認識。在普通中學生物教學大綱中規定的實驗中,大部分要通過顯微鏡來完成,因此,顯微鏡性能的好壞是做好觀察實驗的關鍵。

一、顯微鏡的光學系統

顯微鏡的光學系統主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光器四個部件。廣義的說也包括照明光源、濾光器、蓋玻片載玻片等。

(一)、物鏡

物鏡是決定顯微鏡性能的最重要部件,安裝在物鏡轉換器上,接近被觀察的物體,故叫做物鏡或接物鏡。

1、物鏡的分類

物鏡根據使用條件的不同可分為乾燥物鏡和浸液物鏡;其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡(常用放大倍數為90—100倍)。

根據放大倍數的不同可分為 低倍物鏡(10倍以下)、中倍物鏡(20倍左右)高倍物鏡(40—65倍)。

根據像差矯正情況,分為消色差物鏡(常用,能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡)和複色差物鏡(能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡,價格貴,使用少)。

2、物鏡的主要參數:

物鏡主要參數包括:放大倍數、數值孔徑和工作距離。

①、放大倍數是指眼睛看到像的大小與對應標本大小的比值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例:放大倍數為100×,指的是長度是1μm的標本,放大後像的長度是100μm,要是以面積計算,則放大了10,000倍。

顯微鏡的總放大倍數等於物鏡和目鏡放大倍數的乘積。

②、數值孔徑也叫鏡口率,簡寫NA 或A,是物鏡和聚光器的主要參數,與顯微鏡的分辨力成正比。乾燥物鏡的數值孔徑為0.05-0.95,油浸物鏡(香柏油)的數值孔徑為1.25。

③、工作距離是指當所觀察的標本最清楚時物鏡的前端透鏡下面到標本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關,物鏡的焦距越長,放大倍數越低,其工作距離越長。例:10倍物鏡上標有10/0.25和160/0.17,其中10為物鏡的放大倍數;0.25為數值孔徑;160為鏡筒長度(單位mm);0.17為蓋玻片的標準厚度(單位 mm)。10倍物鏡有效工作距離為6.5mm,40倍物鏡有效工作距離為0.48mm 。

3、物鏡的作用是將標本作第一次放大,它是決定顯微鏡性能的最重要的部件——分辨力的高低。

分辨力也叫解析度或分辨本領。分辨力的大小是用分辨距離(所能分辨開的兩個物點間的最小距離)的數值來表示的。在明視距離(25cm)之處,正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個物點,這個0.073mm的數值,即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小,即表示它的分辨力越高,也就是表示它的性能越好。

顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來決定的,而物鏡的分辨力又是由它的數值孔徑和照明光線的波長決定的。

當用普通的中央照明法(使光線均勻地透過標本的明視照明法)時,顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA

式中d——物鏡的分辨距離,單位 nm。

λ——照明光線波長,單位 nm。

NA ——物鏡的數值孔徑

例如油浸物鏡的數值孔徑為1.25,可見光波長範圍為400—700nm ,取其平均波長550 nm,則d=270 nm,約等於照明光線波長一半。一般地,用可見光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2μm。

(二)、目鏡

因為它靠近觀察者的眼睛,因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。

1、目鏡的結構

通常目鏡由上下兩組透鏡組成,上面的透鏡叫做接目透鏡,下面的透鏡叫做會聚透鏡或場鏡。上下透鏡之間或場鏡下面裝有一個光闌(它的大小決定了視場的大小),因為標本正好在光闌面上成像,可在這個光闌上粘一小段毛髮作為指針,用來指示某個特點的目標。也可在其上面放置目鏡測微尺,用來測量所觀察標本的大小。

目鏡的長度越短,放大倍數越大(因目鏡的放大倍數與目鏡的焦距成反比)。

2、目鏡的作用

是將已被物鏡放大的,分辨清晰的實像進一步放大,達到人眼能容易分辨清楚的程度。

常用目鏡的放大倍數為5-16倍。

3、目鏡與物鏡的關係

物鏡已經分辨清楚的細微結構,假如沒有經過目鏡的再放大,達不到人眼所能分辨的大小,那就看不清楚;但物鏡所不能分辨的細微結構,雖然經過高倍目鏡的再放大,也還是看不清楚,所以目鏡只能起放大作用,不會提高顯微鏡的解析度。有時雖然物鏡能分辨開兩個靠得很近的物點,但由於這兩個物點的像的距離小於眼睛的分辨距離,還是無法看清。所以,目鏡和物鏡即相互聯繫,又彼此制約。

(三)、聚光器

聚光器也叫集光器。位於標本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中,聚光鏡可分為明視場聚光鏡(普通顯微鏡配置)和暗視場聚光鏡。

1、光鏡的主要參數

數值孔徑(NA )是聚光鏡的主要參數,最大數值孔徑一般是1.2—1.4,數值孔徑有一定的可變範圍,通常刻在上方透鏡邊框上的數字是代表最大的數值孔徑,通過調節下部可變光闌的開放程度,可得到此數字以下的各種不同的數值孔徑,以適應不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成,最上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路,使聚光鏡的數值孔徑變小,以適應低倍物鏡觀察時的照明。

2、聚光鏡的作用

聚光鏡的作用相當於凸透鏡,起會聚光線的作用,以增強標本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點設計在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。(聚光焦點正在所要觀察的標本上,載玻片的厚度為1.1mm左右)

3、可變光闌

可變光闌也叫光圈,位於聚光鏡的下方,由十幾張金屬薄片組成,中心部分形成圓孔。其作用是調節光強度和使聚光鏡的數值孔徑與物鏡的數值孔徑相適應。可變光闌開得越大,數值孔徑越大(觀察完畢後,應將光圈調至最大)。

在可變光闌下面,還有一個圓形的濾光片托架。

說明:在中學實驗室只有教師用顯微鏡(1600×或1500×)才配有聚光器,學生用顯微鏡(640×或500×)配的是旋轉光欄。緊貼在載物台下,能做圓周轉動的圓盤,旋轉光欄(也稱為遮光器),光欄上有大小不等的圓孔,叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉動旋轉光欄,光欄上每個光圈都可以對正通光孔,通過大小不等的光圈來調節光線的強弱。

(四)反光鏡

反光鏡是一個可以隨意轉動的雙面鏡,直徑為50mm,一面為平面,一面為凹面,其作用是將從任何方向射來的光線經通光孔反射上來。平面鏡反射光線的能力較弱,是在光線較強時使用,凹面鏡反射光線的能力較強,是在光線較弱時使用。

反光鏡通常一面是平面鏡,另一面是凹面鏡,裝在聚光器下面,可以在水平與垂直兩個方向上任意旋轉。

反光鏡的作用是使由光源發出的光線或天然光射向聚光器。當用聚光器時一般用平面鏡,不用時用凹面鏡;當光線強時用平面鏡,弱時用凹面鏡。

觀察完畢後,應將反光鏡垂直放置。

(五)照明光源

顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源

1、天然光源

光線來自天空,最好是由白雲反射來的。不可利用直接照來的太陽光。

2、人工光源

①、對人工光源的基本要求:有足夠的發光強度;光源發熱不能過多。

②、常用的人工光源:顯微鏡燈;日光燈

(六)濾光器

安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過,而吸收掉其他的光線,即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強度。分為兩大類:濾光片和液體濾光器。

(七)蓋玻片和載玻片

蓋玻片和載玻片的表面應相當平坦,無氣泡,無劃痕。最好選用無色,透明度好的,使用前應洗淨。

蓋玻片的標準厚度是0.17±0.02mm,如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適,都回影響成像質量。

載玻片的標準厚度是1.1±0.04mm,一般可用範圍是1—1.2mm,若太厚會影響聚光器效能,太薄則容易破裂。

二、顯微鏡的機械裝置

顯微鏡的機械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調節光學鏡頭,固定與移動標本等。主要有鏡座、鏡臂、載物台、鏡筒、物鏡轉換器、與調焦裝置組成。

(一)、鏡座和鏡臂

1、鏡座 作用是支撐整個顯微鏡,裝有反光鏡,有的還裝有照明光源。

2、鏡臂 作用是支撐鏡筒和載物台。分固定、可傾斜兩種。

(二)、載物台(又稱工作台、鏡台)

載物台作用是安放載玻片,形狀有圓形和方形兩種,其中方形的面積為120mm×110mm。中心有一個通光孔,通光孔後方左右兩側各有一個安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動式兩種。有的載物台的縱橫坐標上都裝有游標尺,一般讀數為0.1mm,游標尺可用來測定標本的大小,也可用來對被檢部分做標記。

(三)、鏡筒

鏡筒上端放置目鏡,下端連接物鏡轉換器。分為固定式和可調節式兩種。機械筒長(從目鏡管上緣到物鏡轉換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長度或機械筒長)不能變更的叫做固定式鏡筒,能變更的叫做調節式鏡筒,新式顯微鏡大多採用固定式鏡筒,國產顯微鏡也大多採用固定式鏡筒,國產顯微鏡的機械筒長通常是160mm。

安裝目鏡的鏡筒,有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種,雙筒則都是傾斜式的。其中雙筒顯微鏡,兩眼可同時觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調節,而且其中有一個目鏡有屈光度調節(即視力調節)裝置,便於兩眼視力不同的觀察者使用。

(四)、物鏡轉換器

物鏡轉換器固定在鏡筒下端,有3-4個物鏡螺旋口,物鏡應按放大倍數高低順序排列。旋轉物鏡轉換器時,應用手指捏住旋轉碟旋轉,不要用手指推動物鏡,因時間長容易使光軸歪斜,使成像質量邊壞。

(五)、調焦裝置

顯微鏡上裝有粗准焦螺旋和細准焦螺旋。有的顯微鏡粗准焦螺旋與裝在同一軸上,大螺旋為粗准焦螺旋,小螺旋為細准焦螺旋;有的則分開安置,位於鏡臂的上端較大的一對螺旋為是粗准焦螺旋,其轉動一周,鏡筒上升或下降10mm。 位於粗准焦螺旋下方較小的一對螺旋為細准焦螺旋,其轉動一周,鏡筒升降值為0.1mm,細准焦螺旋調焦範圍不小於1.8mm。

三、顯微鏡及其部件的使用

1、使用單筒顯微鏡時,要養成用左眼觀察的習慣(因一般用右手畫圖),觀察時要兩眼同時睜開,不要睜一隻閉一隻,因為這樣易於疲勞。為了訓練學生習慣於兩眼同時睜開觀察,可剪一塊長約14cm,寬約6cm的長方形硬紙片,在靠近左端處挖一個直徑比鏡筒上端外徑略小的圓孔,把圓孔套在鏡筒上段,觀察時兩眼同時睜開,利用紙片的右端擋住右眼的視線,這樣訓練一段時間後,就能習慣於兩眼同時睜開,然後把紙片去掉。

2、直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處,是一個機械關節,可用於調節鏡筒的傾斜度,便於觀察,鏡臂不能過於後傾,一般不超過40°。但是在使用臨時裝片觀察時,禁止使用傾斜關節(當鏡筒傾斜時,載物台也隨之傾斜,載玻片上的液體易流出),尤其是裝片內含酸性試劑時嚴禁使用,以免污損鏡體。

3、目鏡和物鏡的使用

一般都是用一個放大倍數適中的目鏡(10×)和最低倍的物鏡開始觀察,逐步改用倍數較高的物鏡,從中找到符合實驗要求的放大倍數。

轉換物鏡時,先用低倍鏡觀察,調節到正確的工作距離(成像最清晰)。如果進一步使用高倍物鏡觀察,應在轉換高倍物鏡之前,把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央(將低倍物鏡轉換成高倍物鏡觀察時,視野中的物像範圍縮小了很多)。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦(同高調焦),在用低倍物鏡觀察清晰時,換高倍物鏡應可以見到物像,但物像不一定很清晰,可以轉動細准焦螺旋進行調節。

通常認為,使用任何一個物鏡時,有效放大倍數的上限是1,000乘它的數值孔徑,下限是250乘它的數值孔徑。如40×物鏡的數值孔徑是0.65,則上、下限分別為:1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍,超過有效放大倍數上限的叫做無效放大,不能提高觀察效果。低於下限的放大倍數則人眼無法分辨,不利於觀察。一般最實用的放大倍數範圍是500—700乘數值孔徑之間的數字。

4、油浸物鏡的使用

使用油浸物鏡時,一般不要使用同高調焦。同高調焦只適用於每台顯微鏡的原配物鏡,在使用低倍和高倍物鏡時,是一個極有利的方便條件,但在使用油浸物鏡時,則受到一定限制,一般地說,用油鏡觀察未加蓋玻片的標本片(載玻片)時,利用同高調焦的安全度較大,而對於有蓋玻片的標本片,要小心使用,因為油浸物鏡的工作距離很短,在設計和裝配時所考慮的同高是對標準厚度蓋玻片的。

用油浸物鏡時,只在標本片上滴香柏油。觀察完畢後,要及時進行清潔工作,如不及時進行,香柏油粘上灰塵,擦拭時灰塵粒子可能磨損透鏡,香柏油在空氣中暴露時間長,還會變稠、變干,擦拭很困難,對儀器很不利。擦拭要細心,動作要輕。油浸物鏡前端先用乾的擦鏡紙擦一兩次,把大部分油去掉,再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次,最後再用乾的擦鏡紙擦一次。標本片上的香柏油可用「拉紙法」(即把一小張擦鏡紙蓋在香柏油上,然後在紙上滴一些二甲苯,趁濕把紙往外拉,這樣連續三四次,即可乾淨,一般不會損壞未加蓋玻片的塗片標本)擦淨。擦鏡紙也要防塵,一般在使用前,將每頁剪成8小塊,貯存在一個乾淨的小培養皿中,用起來既節省又方便。

5、聚光器的使用方法

①、使用聚光器的原因

當放大倍數增加時,一方面由於放大倍數越高,透鏡數目越多,被透鏡吸收的光線也越多;另一方面由於視場(指的是所能看到被檢標本的範圍)的亮度與放大倍數的平方成反比,即放大倍數越高,視場越暗。為了得到足夠的亮度,必須安裝聚光器,把光線集中到所要觀察的標本上。

②、觀察時聚光器應處的高度

觀察時,要保證得到最好的觀察效果,聚光器的聚光焦點應正好落在標本上。要實現這個條件,就必須調節聚光器的高度。當用平行光照明時,聚光器的聚光焦點是在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm之處,因此,人們常常要求在觀察時將聚光器上升到它上端透鏡平面僅稍稍低於載物台平面的高度,這樣聚光焦點就可能落到位於標準厚度載玻片上的標本上。當使用比標準厚度薄的載玻片來承放標本時,聚光器的位置要相應地降低一些,而當使用過厚地載玻片時,聚光焦點只能落在標本下方,不利於精細的觀察。

③、聚光器與物鏡的配合

這裡所謂的配合,就是使聚光器和物鏡這兩者的數值孔徑取得一致,以更好的進行較為精細的觀察。假如聚光器的數值孔徑低於物鏡,那物鏡的部分數值孔徑就浪費了,從而達不到它的最高分辨力。假如把聚光器的數值孔徑大於物鏡的數值孔徑,則一方面不能提高物鏡的規定分辨力,另一方面反會由於照明光束過寬,使物象的清晰度下降。聚光器與物鏡配合的操作方法是:在完成照明、調焦操作後,取下目鏡直接向鏡筒中看,把聚光器下的可變光闌關到最小,再慢慢地開大。開到它的口徑與所見視場的直徑恰好一樣大,然後按上目鏡,即可進行觀察。每轉換一次物鏡,都要隨著進行依次這樣的配合操作。有的聚光器可變光闌的邊框上刻有表示開啟口徑的尺度,可以根據刻度來進行配合。

歷史上顯微鏡的發明和顯微鏡的每一次創新都給人類的認知帶來了飛躍式的發展;給人類的生活帶來了空前的拓展。在提倡科技創新的今天,顯微鏡的使用已經成為中學生的一項基本技能,掌握結構,科學使用,良好維護,使之成為廣大青少年探索未來世界的一個窗口。  

光學顯微鏡的調試

一、顯微鏡照明光路系統的調整:

為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明,在顯微鏡初次安裝和調試時,就必須把照明光路系統調整好,這是正確使用顯微鏡,並獲得正確、可*結果的重要手段和最基本的要求。此外,正確掌握照明光路系統的調整,是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡後所必經的步驟,也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統的調整主要有以下4項內容:

1、照明光源燈室在顯微外的初步調整

① 首先將燈室的外殼打開,壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中,安裝時避免手指直接接觸燈泡(可用柔軟的布或紙隔住),以免燈泡上留有指紋等臟物,影響燈泡的使用壽命。

② 把燈室擺在桌面上,接通電源後,用專用的螺絲刀調節燈的調焦旋鈕孔(標有「←→」),使燈絲投影在1-2m外的牆上,將燈絲成像調至清晰;然後調節燈的高低位置調節絲孔(標有「──」),使燈絲位置高低適當;再調節燈的左右位置調節螺絲孔(標有「──」),使燈絲左右位置合適。

2、光源發光體(燈絲)在顯微鏡內位置的檢驗和校正 目的是為了把發光體的像端端正正地調入物鏡的視域範圍內,從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明,這是調整庫勒照明系統的前提條件。需要的基本工具:對中望遠鏡購置顯微鏡時已配備。

① 拔掉燈庫內的毛玻璃套筒,把燈室裝回顯微鏡上;

② 選用10×物鏡,開亮光源程序找樣品並調焦清晰,再換用40×物鏡把樣品調焦清晰(40×物鏡可以看清燈絲的全貌);

③ 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到最大;

④ 拔掉其中一個目鏡,換上對中望遠鏡,抓住白色部分,另一手伸縮黑色接目鏡,就可在視野中看到燈絲像;

⑤ 如燈絲位置不合適,調「──」孔,把燈絲像沿水平方向調好,調「──」孔,把絲像沿垂直方向調好,直至將燈絲像調至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像;

⑥ 調整完畢後,將毛玻璃套筒插回原位,拔掉對中望遠鏡,換回目鏡作下一步調整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調整和光源發光體在顯微鏡內位置的校驗,只需在顯微鏡初次安裝調試及更換燈泡時進行,平時使用顯微鏡時不能隨意亂調亂動。萬一調亂時,可按上述步驟調回原狀。

3、庫勒照明(Kohler)系統的正確調整 顯微鏡的正確調試,主要工作之一是照明光路系統的調整,而其中的關鍵是庫勒照明系統的調整。對於每一位使用顯微鏡的人員,特別是作顯微照像的人員來說,應該對庫勒照明系統的原理及其調整步驟有一定的了解和掌握,才能充分發揮顯微鏡應有的功能,拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統的原理簡單來說就是:光源發光體上任意一點發出的光,可以照明顯微鏡的視域範圍,而光源發光體上每一點所發出的光彙集起來,在顯微鏡的視域中就實現了非常充分而又均勻的照明。調整庫勒照明系統的目的,是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明,防止雜散光對照像系統造成影響或干擾,以免照像時在底片形成灰霧。高調整庫勒照明系統的必要部件:視場光闌、可進行合軸調整的聚光鏡系統。

① 選用10×物鏡和10×目鏡;

② 把聚光鏡前端透鏡擺進光路中,孔徑光闌調至適中的位置上(不大不小),再把聚光鏡升到最頂的位置上,聚光鏡轉盤調至明視野「J」位置;

③ 把視場光闌調至最小(0.1);

④ 載物台上放上已封片的生物樣品,開亮光源,調焦清晰;

⑤ 視域中會出現一個局部照明的區域或亮斑,這是視場光闌的模糊像,在其中可以清晰地看到樣品的細節;在它之外是較暗的視域,不一定能把樣品的細節看得清楚;

⑥ 把聚光鏡微微地向下調,使視野中的亮斑逐漸收小,慢慢變成一個清晰的多邊形象,這便是視場光闌的清晰像;

⑦ 一般情況下,多邊形象並不在視域中央,需要調整聚光鏡的一對調中螺絲,把視場光闌多邊形的像調至中央位置;

⑧ 逐漸開大視場光闌,使多邊形象成為視域的內接多邊形,進一步核對調中的狀況,如對中不夠理想,繼續微微調對中螺絲;

⑨ 將視場光闌稍為再微微開大一些,使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上,至此,庫勒照明系統調整完畢。庫勒照明系統調整好以後,整個視域照明均勻,拍攝的顯微照片明亮清晰,反差正常。在日後使用過程中應特別注意: a. 視場光闌不可任意開大,但可隨物鏡倍數的增大而將視場光闌收小,隨物鏡倍數的減小而開大; b. 聚光鏡的高低位置不准亂調,否則會破壞已調整好的庫勒照明系統; c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外,使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中; d. 關於物鏡倍數與視場光闌大小配合問題,在實際使用過程中,作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌,但作顯微照相時,為了避免雜散光線對照相系統的干擾,以便能拍攝到較完善的照片,則應在使用每一個倍數的物鏡時,把視場光闌調節到正好消失於所觀察的視域邊上,這是比較繁複的工作,但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數物鏡相對應的視場光闌事先調整好,並作好記號,以後使用時根據記號直接調至相應的位置。

4、孔徑光闌的正確使用 由於聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的解析度,使用時應掌握正確的使用方法。過去由於對孔徑光闌的認識不足,往往把它當作是調節視野亮度的工具。雖然調節孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度,但會直接影響成像的反差、對比度及解析度,在使用過程中應儘可能避免。為了發揮聚光鏡孔徑光闌的作用,以便在觀察時,尤其在作顯微照相時獲得最佳解析度,在每換用一個倍數的物鏡時,在樣品調焦清晰後,需要調節孔徑光闌,使它的大小正好等於所用物鏡數值孔徑(物鏡孔徑像)的2/3 。 調整方法是用對中望遠鏡對焦於視野中黑色相差環上,調節孔徑光闌,可以看到一個邊形的孔徑光闌像,然後調到等於物鏡孔徑像的2/3,即介於黑色相差環外與圓形視域內之間。為方便起見,可把與各倍數物鏡相對應的孔徑光闌預先調整好,並作好標記,以免每次使用都要重新調整。

二、顯微鏡成像光路系統的調整及顯微鏡檢術概要:

顯微鏡成像光路系統的調整,是根據不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術(microscopy),概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法,以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統的調整方法。

1、透射光明視野:

這是自顯微鏡發明以來最傳統、最普遍的應用方法。基本部件: a. 物鏡:任何物鏡都可作明視野觀察; b. 聚光鏡:各種聚光鏡均可,最好配有孔徑光闌。調整方法:在上述顯微鏡的庫勒照明系統調整好後,即可應用明視野法。適用範圍:所有已染色的組織切片血液塗片等。注意事項: a. 使用明視野方法觀察時,一定要將庫勒照明系統調整好; b. 視場光闌不可任意開大,使用10×、10×以下和10×以上物鏡時,要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中; c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調節視野的亮度,更不要亂調聚光鏡的高低位置,否則,會降低顯微鏡的解析度和破壞已調整好的庫勒照明系統; d. 作顯微照相時,每換用一個倍數的物鏡,就要調節聚光鏡的孔徑光闌,使它的大小正好等於所用物鏡數值孔徑的2/3 。

2、透射光相差法:

這是現代顯微鏡檢術中的一種反差增強法。基本部件:相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。

調整方法:

a. 在庫勒照明系統調整好的基礎上,用明視野方法把樣品調焦清晰;

b. 把聚光鏡轉到Ph1對準轉盤刻度線位置,選用10×相差物鏡,換上待觀察的透明樣品;

c. 拔掉其中一個目鏡,換上對中望遠鏡,並調焦於視野中的兩個相差環上(物鏡的黑色相差環和聚光鏡的透光相差環);

d. 視野中的兩個相差環不一定重合,調節聚光鏡上的兩個調節裝置(調整相差環左右位置的調節桿和調整前後位置的摩擦式轉鈕),使透光環作前後左右移動而與黑環重合;

e. 調整好後,換回觀察用目鏡,將綠色濾光片按入光路中,即可觀察到樣品的相差像;

f. 有20×和40×物鏡觀察時,聚光鏡應設在Ph2位置上,用100物鏡時,聚光鏡應設在Ph3位置上。

適用範圍:適用於觀察透明、未染色或不能染色的樣品,如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

3、微分干涉相襯法:

為了克服相差法觀察時樣品細節像周圍伴隨有光暈,會掩沒掉本來應該看見的細節,以及樣品或組織切片厚度要求相當薄,原則上下能厚於10?m等局限性,利用雙光束干涉的原理設計子微分干涉相襯法。

調整方法:

a. 必須在庫勒明系統已調好的基礎上才能調好DIC方法;

b. 先用10×物鏡,以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調焦位置;

c. 把起偏器(polarizer)擺入照明光路中,注意其取嚮應為東—西方向;

d. 把聚光鏡轉盤轉到與10×物鏡對應使用的位置上,即DIC 0.3—0.4;

e. 在物鏡後方或物鏡轉換器上插入10×物鏡使用的DIC插片(DIC slider);

f. 把檢偏器(analyser)插入成像光路中,注意其取嚮應為南—北方;

g. 換上待觀察的透明樣品,開亮光源把樣品調焦清晰;

h. 調節DIC插片,使微分干涉相襯的像達到最佳效果,也就是浮雕效果最為明顯;

i. 同時可調節聚光鏡的孔徑光闌,使反差的效果也達到最佳;

j. 然後再細微調樣品的細節,可見樣品中不同層面上的結構;

k. 如果把補色器(first order red retardation plate)插入,並同時調節DIC插片,可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩,紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用範圍:透明或不能染色的組織切片,厚度可達100?m左右,培養中的活組織和活細胞、小生生物等。

4、落射光激發的熒光法(incident-loght fluorescence Epi-FL):

簡稱為落射熒光法,是近代顯微鏡檢術中新發展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發熒光用的光源改在物鏡的上方,光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品,從樣品上被激發的熒光經物鏡成像並穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便,效率高,50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品,只要樣品中含有可產生熒光的成分,它便吸收短波的激發光而釋放出波長較長的熒光。不同物質只能吸改特定波長的激發光,而釋放的熒光也會有特定的波長,因而用作特異性的鑒定十分有效,如某些致病的細菌和螺旋體,受紫外光激發後能發出它們特有的熒光,很容易作出鑒定,這種利用物質吸收激發光後放出特有熒光的方法稱為自發熒光法。某些物質自身不會吸收激發光,或吸收後不能釋放熒光,但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料,而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發光,再釋放出特定的熒光,從而間接地鑒別出某種物質,這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用於醫學、生物學及工業的特異性研究和鑒別上。調整方法:熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡,調整的方法大致相同。

① 汞燈的安裝:

a. 打開包裝,取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上,安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面,汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側或右側;

b. 把汞燈的上電極引張安裝並固定在散熱帽底面的小孔上,再把汞燈的下電極及上電極引線另一端,分別安裝在燈座上各自的插孔中並固定;

c. 鎖緊散熱片上的螺絲後,把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中,鎖緊相應的螺絲,再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源後部專用的插座上。

d. 詳細的安裝方法請參照有關說明書。

② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調整:

a. 接通汞燈電源,讓汞燈預熱10-15min;

b. 把汞燈燈室擺放在桌面上,讓汞弧投影到2-3m外的牆上,劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線;

c. 轉動燈室調焦旋鈕,使汞弧的像清晰地投影於牆上;

d. 分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔,把汞弧的像其反射像調成並排且盡量*近,但不要重疊在一起。

③ 汞燈汞弧在顯微鏡內位置的檢驗:

a. 將汞燈照明光路系統中的視場光闌開到最大;

b. 把熒光濾光片組推到藍光激發的位置上,以避免汞燈中的藍光太刺眼;

c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物台上,蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙;

d. 取下一個物鏡,使激發的藍光經物鏡轉換器的空檔照在白紙上,白紙上會有一藍色的圓形照明區域,汞弧的像及其反射像都應該出現在這區域的中央部位,否則,可調節燈室調焦旋鈕至最清晰,然後分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔,直至汞弧的像及其反射像並排在照明區域的中央位置。

e. 調好之後,把物鏡裝回去,通過目鏡可見白紙被藍光激發後發射出的黃綠色熒光;

f. 仔細調焦,可看清白紙的纖維;取去白紙,樣品上的熒光細節隱約可見而很容易調焦清晰。

④ 汞燈使用注意事項 目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈,燈管內通有一對鎢電極和液態汞(室溫下附在管壁上),未點燃時,管內氣壓很低,在燈管的兩電極間施加電壓角發點燃後,汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產生強光,溫度升高,管內氣壓迅速升到10個大氣壓。由於是高氣壓的氣體放電,必須了解其特性才能安全地使用汞燈。

a. 汞燈接通電源後需要10-15min預熱時間,汞才能充分汽化並形成汞弧,產生高亮度而穩定的激發光。因此,觀察前要提早通電;

b. 汞燈在使用過程中,不要隨意開關汞燈的電源;

c. 關掉汞燈電源後,必須等待15-20min,待汞燈自燃冷卻後才可再次接通電源,違反這一操作規定時,將會造成嚴重後果!由於汞燈內的汞蒸氣未完全液化,汞蒸氣內阻很小,一旦通電在兩電極間施加電壓,汞燈內形成強大的電流,輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈,重則汞燈爆炸,汞蒸氣瀰漫整個實驗室,造成工作人員中毒,不僅損失了汞燈,還會炸毀燈室內的集光-聚光部件。

d. 汞燈的使用壽命一般只有300h,使用得當可達600h,使用壽命與開關的次數成反比,應集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴,應珍惜使用。

e. 汞燈壽命終結的標誌是點燃困難,燈管發黑。

5、暗視野法(dark field):

許多透明或半透明的樣品,如細菌、微生物、細胞內的精細結構及結晶體的內含物等,在明視野顯微鏡中不容易看清楚,如果採用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發亮的樣品輪廓及其細節。普遍光學顯微鏡的最高解析度為0.2μm,而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節構造分辨不清楚,但卻可看到0.004μm以上微細顆粒的存在,即可以看到亞顯微結構,特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等。調整方法:暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統調整好。換上暗視野聚光鏡時,要把載玻片(樣品)移開,將浸沒油滴在聚光鏡頂部,再把樣品載玻片擱在物台上,浸沒油便充填在兩者之間,這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率乾式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用,這種聚光鏡具有中央光擋,照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環才能進入聚光鏡內。對於配備齊全的相差顯微鏡,與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環,可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。

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